产3-羟基丙酸肺炎克雷伯氏菌基因表达调控元件的研究
3-羟基丙酸（3-HP）作为重要的平台化合物，有着广阔的市场前景。Klebsiella pneumoniae因其较高的甘油耐受性、较强的甘油代谢能力、发酵周期短等特点成为利用甘油生物法生产3-HP的优势宿主菌。但由于可用启动子相对较少，且少数已知可用的启动子转录活性相对较弱，造成3-HP的生产过程转化率较低。本研究针对这一问题进行探索，通过构建K.pneumoniae高效表达系统，对K.pneumoniae甘油代谢途径进行改造，实现3-HP的高产。 1、选择K.pneumoniae中13个生长代谢必需基因的启动子构建组成型启动子库，利用GFP报告系统对启动子进行筛选，获得了具有较高转录活性的组成型启动子Pkan，该表达系统无需加入诱导剂即可实现相对恒定的高效表达，其转录活性约为K.pneumoniae常用表达系统pET-pk的1.7倍，且对菌体的生长代谢影响较小，可用于构建K.pneumoniae高效组成型表达系统。 2、为提高3-HP产量，利用Pkan过表达来自Escherichia coli醛脱氢酶基因aldH，构建的重组菌可实现甘油到3-HP的高效转化。重组菌的摇瓶发酵数据表明，3-HP产量为0.47g/L，与野生菌相比提高了89.5％，与具有相同代谢负荷的空质粒对照菌相比增加了238％。上罐发酵实验，目的产物的产量为15.28g/L，甘油转化率达13.02％，时空产率为0.57g·L-1·h-1。 3、为提高启动子的转录活性，对tac启动子核心序列进行串联获得复合启动子。利用此表达系统过表达醛脱氢酶基因puuC，构建的重组菌可实现3-HP的高产。重组菌摇瓶发酵结果表明重组菌K.p(pETP3 co re-tac-puuC)、K.p(pE TP5 core-tac-puuC)的3-HP产量分别为2.88g/L、3.10g/L。上罐发酵结果表明，3-HP的终产量分别为99.8g/L，81.4g/L;甘油转化率分别是87.7％，69.3％;时空产率分别为1.04g.L-1.h-1，1.36g·L-1·h-1。重组菌K.p(pETP3core-tac-puuC)的3-HP产量为目前报道最高，且在发酵结束时，乳酸的产量接近0g/L，这对于3-HP的实际生产具有十分重要的意义。
发酵工程;3-羟基丙酸;肺炎克雷伯氏菌;基因重组
北京化工大学
硕士
药学
田平芳
2016
中文
TQ921
100
2017-01-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）