基因工程酶法高效再生ATP耦合生产谷胱甘肽
谷胱甘肽在医药领域、食品领域以及美容方面都有广泛应用。一直以来关于谷胱甘肽的生产方法、分离手段等的研究层出不穷，但是关于怎么提高谷胱甘肽的产量，因为生产条件限制、谷胱甘肽双功能酶的产物抑制作用等原因，目前为止仍然是亟待解决的难题。 体外酶催化法生产谷胱甘肽的方法因为生产过程容易调节相关的各个因素，所以是近年来广泛研究的一种简单有效的生产方法，但是ATP供给问题是该方法的一个重要的限制条件，所以体外酶法生产谷胱甘肽目前还不能很有效的应用于工业生产。 本课题针对上述两个问题分别进行研究，得到了明确的实验结果:利用体外酶法耦合特定菌种来源的多聚磷酸激酶和谷胱甘肽合成双功能酶两种酶，最终实现简单、高效率、低成本生产谷胱甘肽的目标。课题中应用的多聚磷酸激酶和谷胱甘肽合成双功能酶的来源是研究成功的关键因素。 课题的研究内容路线设计主要有以下几点: (1)查阅文献分别对比各种菌种来源的多聚磷酸激酶(PPK)和谷胱甘肽合成双功能酶(GS)的催化效果和酶催化动力学参数，选择对应合适的基因ppk和gs。然后以选择的合适基因片段为目的基因，构建目的基因的重组载体，异源表达成功得到目的蛋白。SDS-PAGE蛋白电泳法作为目的蛋白是否成功表达的检测手段，验证ppk和gs对应的催化酶PPK和GS的成功表达。 (2)用异源表达的高效低耗的多聚磷酸激酶(PPK)和产物抑制作用弱的谷胱甘肽合成双功能酶(GS)做体外酶法耦合催化生产谷胱甘肽的尝试。在初步尝试成功的基础上，优化反应体系中各物质的浓度，确立影响反应的关键因素之后对反应关键条件进行逐个优化，最终得到耦合反应的最适条件。优化结果显示，谷胱甘肽生产体系可以从30 mM扩大到50mM;在优化得到的反应条件下，与同类生产方法相比，GSH产量由8g·L-1提高到13 g·L-1，对应转化率为83.8％;与此同时，耦合反应体系中外源ATP的加入量仅为体系需求总量的20％。总之，与前人研究成果相比，本课题使谷胱甘肽产量提高1倍，同时反应底物成本降低67.9％，这对于工业生产谷胱甘肽是一个重大突破。 (3)在上述研究成果显著的基础上，扩大耦合催化反应体积继续进行探索。首先对含有重组载体的菌株进行高密度发酵，高压匀浆破胞得到大量的粗酶液。以粗酶液为催化载体，扩大耦合反应体积到250mL。体积扩大后耦合反应生成的GSH浓度仍能达到12.32g·L-1，对应转化率为80.24％。 本课题的突破点在于，运用Pasteurella multocida来源的谷胱甘肽合成双功能酶GS产物抑制效应弱，允许催化反应体系浓度提高到50mM，为提高谷胱甘肽GSH的产量提供了可靠的基础。运用corynebacteriumglutamicum来源的多聚磷酸激酶PPK不仅能以低聚合度的多聚磷酸为磷酸供体，而且催化效率高，能在耦合反应中催化ATP循环再生高达4次。
谷胱甘肽;体外酶法;多聚磷酸激酶;谷胱甘肽合成双功能酶;耦合反应
北京化工大学
硕士
药学
刘珞
2016
中文
TQ936
98
2017-01-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）