锰离子敏感类弹性蛋白修饰超氧化物歧化酶及其双酶体系的研究
锰超氧化物歧化酶是一种抗氧化的金属酶，它广泛存在于各种生物体中，其表达量与酶活力会受锰离子浓度的影响，适量浓度的锰离子会提高酶活力;另外，在类弹性蛋白中嵌入一段结合锰离子的序列，有助于类弹性蛋白在纯化过程中发生相变。类弹性蛋白是一类由五肽重复序列(VPGXG)构成的聚合物，具有随着温度变化发生可逆相变的性质，在它融合一段蛋白时仍有此性质，据此类弹性蛋白可作为其他蛋白的纯化标签，在类弹性蛋白二倍体中嵌入一段锰离子结合蛋白(P1D2E3K4H5E6L7)，然后利用递归定向连接技术(RDL)，将其构建成十倍体，再与超氧化物歧化酶无缝融合。这段特定序列经转录和翻译得到的蛋白，可以结合二价锰离子，并形成疏水的颈环结构，在水溶液中容易聚集，更有利于ELP析出，以提高纯化效果;另外，恰当浓度的锰离子能促进SOD的酶活，所以本实验采用锰盐纯化SOD。 论文对基于超氧化物歧化酶和过氧化氢酶构建的双酶体系进行了研究。SOD使超氧负离子发生岐化产生H2O2，过氧化氢酶能分解H2O2，解除SOD酶催化过程中的产物抑制效应，提高酶活力。本文选用Ssp DnaE断裂内含肽，分别与SOD、CAT在同一载体中构建了两个表达框，同时，为了避免两个酶剪接后结构发生变化，本试验选用刚性连接子(EAAAK)5为间隔序列。将构建成功的载体进行表达，并用镍柱纯化，最后进行酶活测定，结果表明等量的双酶体系比SOD单酶催化效率提高一半。另外，采用内含肽介导的SOD与CAT体外剪切并测剪切效率，分别构建SOD-InteinC和CAT-InteinN载体，导入大肠杆菌DH5a感受态中，酶切鉴定，提质粒，转化BL21感受态，表达，使用镍柱纯化，透析，体外剪切，电泳直观反映剪切结果，结果显示1mMDTT，pH7.5，25℃摇床培养24 h，SOD与CAT摩尔量比3∶1为双酶体外剪切的最佳条件。
超氧化物歧化酶;类弹性蛋白;纯化工艺;锰离子;剪切效率
北京化工大学
硕士
轻工技术与工程
冯嵬
2016
中文
TQ925
96
2017-01-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）