日本三角涡虫Neurotrophin信号通路关键基因及flotillins基因的克隆及功能分析
日本三角涡虫（Dugesia japonica）隶属扁形动物门(Platyhdminthes)，涡虫纲(Turbellaria)，在动物系统演化中占有重要地位，并且涡虫具有极强的再生能力。目前，虽然已克隆大量与涡虫再生相关的基因，但其再生机制及相关基因的功能仍不清楚。 本文利用RACE技术、Real-time PCR技术、整体原位杂交技术、免疫荧光技术以及RNA干扰技术对日本三角涡虫神经营养因子信号通路(Neurotrophin signalingpathway)关键基因Djras、Djshc、Djakt、Djmekl、Djmek2的cDNA全长进行扩增，并对五基因以及Djflotillins基因进行时空表达模式和功能分析，结果如下: (1)首次克隆了日本三角涡虫Djras基因的cDNA全长，共1219bp，最大开放阅读框（ORF）为555 bp，编码一个由184个氨基酸残基组成的蛋白质，该蛋白包含鸟苷酸结合域、GAP作用位点和GEF作用位点三个保守的基序以及一个CaaX模块;进化分析表明Ras蛋白在不同的物种间高度保守，DjRas蛋白在进化上较其他扁形动物更为原始。Real-time PCR结果表明:Djras基因在涡虫切割去头后呈上调表达趋势，特别是在再生1、7天显著上调;整体原位杂交结果显示:Djras基因在涡虫头部脑神经节周围及肠支表达，在再生芽基部位强烈表达;干扰Djras基因后延缓涡虫头再生，并显著抑制涡虫正常尾再生。以上结果表明Djras基因在涡虫再生过程中起着关键调控作用。 (2)首次克隆了Djshc基因的cDNA全长，共1728 bp，最大开放阅读框(ORF)为750 bp，编码一个由249个氨基酸残基组成的蛋白质，该蛋白质包含PTB和SH2结构域;进化分析表明Shc蛋白质在不同的物种间相对保守，扁形动物门的shc基因在进化上较原始。Real-time PCR结果表明:Djshc基因在涡虫切割去头后第1、7天呈上调表达趋势;整体原位杂交结果显示:Djshc基因在整体涡虫身体两侧及肠支部位表达，在再生涡虫芽基部位强烈表达;RNA干扰结果表明:Djshc基因干扰后部分涡虫头再生尾受到抑制，并且整体涡虫以及再生头都均出现多眼点畸形。以上结果表明:Djshc基因能够调控眼点正常分化且参与涡虫再生。 (3)首次克隆了日本三角涡虫Djakt基因的cDNA全长，共2067 bp，最大开放阅读框(ORF)为1758 bp，编码一个由585个氨基酸残基组成的蛋白质，该蛋白质包含三个保守结构域;进化分析表明Akt蛋白在不同的物种间高度保守，akt基因在扁形动物中具有同一起源。Real-time PCR结果表明:Djakt基因在涡虫切割去头后1天显著上调表达;整体原位杂交结果显示:Djakt基因在涡虫再生前期的芽基部位以及再生后期的芽基基部强烈表达;干扰Djakt基因后抑制涡虫头再生尾。以上结果表明Djakt基因参与涡虫再生及身体重塑。 (4)首次克隆了日本三角涡虫Djmek1/2基因的cDNA全长，其中Djmek1基因的cDNA全长共1721 bp，最大开放阅读框(ORF)为1419bp，编码一个由472个氨基酸残基组成的蛋白质;Djmek2基因的cDNA全长共1743 bp，最大开放阅读框(ORF)为1278 bp，编码一个由425个氨基酸残基组成的蛋白质;两蛋白都包含一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化域以及一个保守的Scr-X-Ala-X-Scr基序;进化分析表明DjMek1和DjMck2氨基酸序列的同源性为48％，DjMek2较DjMek1蛋白保守性更高;两基因的Real-time PCR结果表明:Djmek1基因在涡虫切割去头后第1天呈显著上调表达，第5天下调表达;Djmek2基因在涡虫切割去头后第1、7天呈上调表达趋势;整体原位杂交结果表明:两基因表达部位相似，都在涡虫的肠支和再生芽基部位表达;RNA干扰结果显示:单独干扰任何一个基因涡虫没有显著形态变化，两基因同时干扰后出现再生速度慢、歪尾及尾缺刻等畸形。以上研究结果表明:两基因在日本三角涡虫中具有相似的功能且具有互补性，在涡虫再生过程中起着重要作用。 (5)Djflotillins基因整体原位杂交结果表明:两基因在整体涡虫中除中枢神经系统和咽部外广泛表达，在再生涡虫的芽基部位表达;RNA干扰结果表明:Djflotillin-1干扰后整体涡虫出现耳突收缩，头部钝圆等畸形，且抑制再生或再生速度变慢;Djflotillin-2干扰后整体涡虫无显著变化，但是在尾再生头过程中再生速度减慢;同时干扰两基因后其结果与Djflotillin-1干扰后相似;两基因干扰后都出现胞吐及运动速度显著变慢现象。免疫荧光结果表明:两基因干扰后中枢神经系统再生正常。以上结果表明:1）Djflotillins基因与涡虫再生相关，但并没有参与涡虫中枢神经系统的功能维持与再生;2)Djfiotillins基因可能通过调节肌动蛋白细胞骨架促进涡虫的运动;3）Djflotillins基因与涡虫吞噬作用相关。
日本三角涡虫;神经营养因子;信号通路;基因表达
河南师范大学
博士
生物学、动物学
陈广文;董自梅
2016
中文
Q959.151.2
145
2017-01-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）