多肽壳聚糖川芎嗪纳米粒逆转肿瘤细胞耐药作用研究
目的: 合成多肽偶联壳聚糖，制备多肽壳聚糖川芎嗪纳米粒(pEGF-CS-TMP-NPs)，初步研究其逆转肿瘤细胞多药耐药作用与机制。 方法: 1.以谷胱甘肽为偶联剂，通过酰胺反应制备巯基壳聚糖，优化巯基壳聚糖制备工艺。通过分子内二硫键的形式将表皮生长因子受体(EGFR)特异性配体多肽(pEGF)修饰于巯基壳聚糖表面，从而合成多肽偶联壳聚糖。红外光谱、核磁共振光谱分析产物的结构表征。 2.离子交联法制备pEGF-CS-TMP-NPs，透射电镜观察pEGF-CS-TMP-NPs的形态，激光粒度分析仪测定粒径、分散度、Zeta电位，高效液相色谱(HPLC)法测定包封率、载药量。 3.选择EGFR高表达的人乳腺癌耐药细胞(MCF-7/ADR)和EGFR阴性表达的人白血病耐药细胞(K562/ADR)作为细胞模型，MTT法测定细胞的耐药倍数。两种耐药细胞分别给予0.10、1.00、10.00、50.00、100.00μmol·L-1的阿霉素，相应的敏感细胞分别给予0.05、0.10、0.50、1.00、10.00μmol·L-1的阿霉素，给药处理48h，加入MTT，随后用酶标仪于492nm处检测吸光度值，计算各给药组细胞存活率，利用计算机Origin软件绘制标准曲线，分别计算四种细胞的IC50，并计算出耐药倍数。 4.MTT法检测pEGF-CS-TMP-NPs的细胞毒作用。选取耐药细胞MCF-7/ADR和K562/ADR，分别加入0.03、0.06、0.12、0.25、0.50μg·mL-1的多肽壳聚糖川芎嗪纳米粒(pEGF-CS-TMP-NPs)。给药处理48 h，加入MTT，随后用酶标仪于492nm处检测吸光度值，采用Origin软件分别计算两种耐药细胞的IC95（细胞存活率为95％时的药物浓度）、IC90（细胞存活率为90％时的药物浓度）、IC85（细胞存活率为85％时的药物浓度）和IC80（细胞存活率为80％时的药物浓度）。 5.选取MCF-7/ADR、K562/ADR两种细胞，每种细胞的实验给药分组分为四组，第一组分别给予不同浓度的pEGF-CS-TMP-NPs(0.03125、0.0625、0.125、0.25μg·mL-1)和阿霉素(1μg·mL-1)，第二组单纯给予阿霉素(1μg·mL-1)，第三组单纯给予pEGF-CS-TMP-NPs(0.0625μg·mL-1)，第四组为空白组，只加入培养基和细胞。给药后常规培养48 h后，酶标仪于492nm处检测吸光度值。计算两种细胞各组的细胞存活率。 6.MTT法测定逆转前后阿霉素耐药指数测定。选择MCF-7/ADR、K562/ADR两种耐药细胞，每种细胞分为两组，分别给予pEGF-CS-TMP-NPs的无毒剂量IC95、IC85，给药24h后，分别加入不同浓度阿霉素（0、0.1、1.0、10.0、50.0、100.0μmol·L-1），继续培养至48h，酶标仪于492nm处检测吸光度值。计算各给药组细胞存活率，利用计算机Origin软件绘制标准曲线，分别计算两种细胞的IC50，并计算出逆转指数。逆转指数=逆转前IC50/逆转后IC50。 7.Western Blotting法检测细胞耐药相关蛋白P-gp和EGFR的表达水平。选择MCF-7、MCF-7/ADR、K562、K562/ADR四种细胞，IP裂解液提取胞膜总蛋白，检测细胞中P-gp和EGFR表达情况，并以β-actin为内参，计算P-gp和EGFR的表达水平。 8.Western Blotting法检测P-gp表达水平。选择MCF-7/ADR和K562/ADR细胞，分别给予IC95、IC90、IC85三个浓度的pEGF-CS-TMP-NPs，给药后48h提取蛋白，利用Western Blotting法检测两种耐药细胞在不同浓度分组下的P-gp表达水平。 结果: 1.合成巯基壳聚糖。红外扫描图谱显示壳聚糖与巯基壳聚糖在3425cm-1都有-NH2和-OH的伸缩震动峰，而巯基壳聚糖在1626cm-1、1516cm-1新出现C=O和C-N的伸缩振动峰。核磁图谱显示，巯基壳聚糖新增加三个位移值，分别为三个亚甲基的位移，δ2.7是与-SH相邻的两个亚甲基，δ1.3是与亚胺基相邻的亚甲基，表明巯基已经连接到壳聚糖表面。经过对巯基壳聚糖合成工艺优化发现，当pH=6.0且反应物巯基壳聚糖、谷胱甘肽、1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐与N-羟基丁二酰亚胺的质量比为1∶1∶3∶1.5时，合成的巯基壳聚糖的巯基含量最高。对比合成的多肽偶联壳聚糖与壳聚糖的核磁图谱，结果可见在δ7.0，δ6.8，δ6.7处新增加三个位移值，经过分析可知此为氨基酸中的芳香氢，说明pEGF已成功偶联到壳聚糖分子表面。 2.激光粒度仪测定纳米粒的结果:粒径为150.50+9.3nm，分散度(PDI)为0.059±0.007，Zeta电位为19.30±2.02mv。透射电镜下观察，纳米粒形态大部分成球形，分散度良好。采用HPLC法测得多肽壳聚糖纳米粒的包封率为37.66±0.53％，载药量为3.25±0.34％。 3.采用MTT法检测并计算各给药组细胞存活率，利用计算机Origin软件绘制标准曲线，计算出MCF-7、MCF-7/ADR、K562、K562/ADR细胞的IC50分别为0.703、65.78、0.93、＞100μmol·L-1。从而计算出MCF-7/ADR的耐药倍数为93.5倍，K562/ADR的耐药倍数大于100倍。 4.pEGF-CS-TMP-NPs对MCF-7/ ADR和K562/ ADR细胞的细胞毒作用均较小。且在纳米粒为低浓度时，即纳米粒浓度为0.06、0.12、0.25μg·mL-1，对MCF-7/ADR的敏感性高于K562/ADR，这可能与纳米粒的主动靶向性相关。当纳米粒浓度增加至0.50μg.mL-1时，两者细胞对纳米粒的敏感性未见明显差异。pEGF-CS-TMP-NPs作用于MCF-7/ADR细胞的IC95、IC90、IC85和IC80分别为0.03、0.08、0.16、0.24μg.mL-1，作用于K562/ADR细胞的IC95、IC90、 IC85、IC80分别为0.08、0.16、0.24、0.30μg.mL-1。 5.pEGF-CS-TMP-NPs联合阿霉素作用于两种细胞时，与单独给予阿霉素比较，pEGF-CS-TMP-NPs联合阿霉素给药能够显著降低两种耐药细胞存活率，经统计学处理，存在显著性差异，表现出对阿霉素抗肿瘤作用的增敏作用，而且该作用与联合pEGF-CS-TMP-NPs的浓度成正相关。其中对EGFR阳性表达的MCF-7/ADR细胞的敏感性明显高于EGFR阴性表达的K562/ADR，这与pEGF-CS-TMP-NPs的主动靶向性有关。 6.将pEGF-CS-TMP-NPs的IC95作为给药浓度时，两种耐药细胞MCF-7/ADR和K562/ADR的逆转指数分别为1.21和1.31，逆转指数无明显差异;而将pEGF-CS-TMP-NPs的IC85作为给药浓度时，MCF-7/ADR和K562/ADR的逆转指数分别为3.68和1.87，逆转指数存在明显差异。显示pEGF-CS-TMP-NPs对耐药细胞MCF-7/ADR的敏感性明显高于对耐药细胞K562/ADR的敏感性。 7.Western Blotting结果显示P-gp在两种耐药细胞MCF-7/ADR和K562/ADR中均高表达，而在细胞MCF-7和K562中为阴性表达;EGFR在细胞MCF-7和MCF-7/ADR中为阳性表达，而在细胞K562和K562/ADR细胞中为阴性表达。其中EGFR在细胞MCF-7/ADR中的表达水平明显高于在细胞MCF-7中的表达。 8.两种耐药细胞给予pEGF-CS-TMP-NPs作用后，Western Blotting检测P-gp表达情况。结果显示，P-gp在EGFR阳性表达的MCF-7/ADR细胞中的表达水平明显下降，而在EGFR阴性表达的K562/ ADR细胞中的表达量无明显变化。可以判断pEGF-CS-TMP-NPs逆转肿瘤MDR的机制与下调肿瘤耐药相关蛋白P-gp相关。 结论: 本实验采用低毒、价格低廉的谷胱甘肽制备了巯基壳聚糖，完成了多肽偶联壳聚糖的合成以及pEGF-CS-TMP-NPs的制备。制备的pEGF-CS-TMP-NPs理化性质稳定，分散均匀并具有一定的缓控释作用。体外实验表明，pEGF-CS-TMP-NPs具有良好的靶向逆转MCF-7/ ADR细胞多药耐药作用，其良好的靶向性可能与药物的壳聚糖纳米粒的多肽修饰有关，而逆转作用可能是通过下调多药耐药相关蛋白P-gp表达水平实现的。
多肽壳聚糖;川芎嗪纳米粒;制备工艺;肿瘤细胞;耐药活性
大连医科大学
硕士
药理学
范青
2016
中文
TQ460.6
53
2017-01-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）