特异性抑制CYP4A对AGEs诱导的心肌氧化应激损伤的保护研究
晚期糖基化终产物(advanced glycation end-products，AGEs)是蛋白质、脂质或核酸与糖在非酶条件下反应生成的不可逆的大分子复合物。AGEs不仅在糖尿病患者体内异常升高，大量摄入烘焙食物及吸烟均可使其异常升高。AGEs在体内致病广泛。近年来研究表明AGEs可通过上调氧化应激水平导致心肌损伤，因此防治AGEs诱导的心肌损伤具有重要的意义。细胞色素氧化酶P4504A(Cytochrome P450 enzymes4A，CYP4A)是CYP家族中最主要的ω-羟化酶，在心肌组织高表达，对心血管功能调节有重要意义。有研究表明CYP4A能够介导糖尿病血管内皮细胞的氧化损伤信号通路，通过抑制ERK1/2促进凋亡而参与心肌缺血再灌注损伤。然而CYP4A是否参与了AGEs诱导的心肌氧化损伤及针对该靶点进行有效干预能否减轻心肌损伤在国内外尚未见报道。 目的:本实验从整体动物和细胞两个水平分别探究特异性抑制心肌CYP4A对外源性AGEs诱导的心肌氧化应激损伤的作用，从而为AGEs诱导的心肌损伤的治疗提供新的靶点。 方法:1.特异性抑制CYP4A对AGEs诱导的小鼠心肌氧化损伤的保护作用研究 1.1 AGEs的制备 将终浓度为0.5 mol/L的D-葡萄糖(D-glucose，D-G)、50 g/L的牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)、0.5 mmol/L的乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid, EDTA)和1.5mmol/L的苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)溶解于PBS(0.2mol/L， pH7.2)。过滤除菌，37℃避光孵育90天后采用荧光酶标仪测定荧光强度确定其浓度。 1.2特异性抑制CYP4A对AGEs诱导的小鼠心肌氧化应激损伤的保护作用研究 36只健康C57BL/6小鼠，雄性，体重16～20g，随机分4组:BSA对照组(BSA)，给予BSA、HET0016组(BSA+HET0016)，AGEs组(AGEs)，给予AGEs、HET0016组(AGEs+HET0016)。采用灌胃的造模方式，分别给予AGEs或者BSA500μg/kg/d，连续灌胃60天，第47天开始，腹腔注射CYP4A特异性抑制剂N-hydroxy-N‘-(4-butyl-2 methylphenyl) formamidine(HET0016)2.5mg/kg/d或等量溶媒对照，连续14天。检测小鼠心肌组织丙二醛(malondialdehyde，MDA)、过氧化氢含量及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的活力;采用Western blot法检测各组CYP4A、NOX2、核内NF-κB、p-Akt、Akt、p-JNK、JNK、c-caspase-3(cleavedcaspase-3)、B-cell lymphoma-extra large(Bcl-xL)蛋白表达水平。采用TUNEL法检测各组心肌细胞凋亡情况。 2.特异性抑制CYP4A对AGEs诱导的H9c2细胞氧化应激损伤的保护作用研究 2.1应用特异性抑制剂HET0016阻断CYP4A对AGEs诱导的H9c2细胞氧化应激损伤的保护作用研究 H9c2细胞随机分为4组:BSA对照组(BSA(10μM))，给予BSA、HET0016组(BSA(10μM)+HET(2μM))，AGEs组(AGEs(10μM))，给予AGEs、 HET0016组(AGEs(10μM)+HET0016(2μM))。检测H9c2细胞中SOD活力、MDA含量;应用流式细胞仪检测ROS水平;采用Real-time qPCR法检测各组CYP4A1、CYP4A2、CYP4A3基因表达水平;采用Westem blot法检测各组CYP4A、NOX2、核内NF-κB、p-Akt、Akt、p-JNK、JNK、c-caspase-3、Bcl-xL蛋白表达水平。应用TUNEL法检测各组H9c2细胞凋亡情况。 2.2.应用RNA干扰特异性沉默CYP4A对AGEs诱导的H9c2细胞氧化应激损伤的保护作用研究 H9c2细胞随机分为4组:BSA+si-control，BSA+si-RNAs，AGEs+si-control，AGEs+si-RNAs。其中，si-RNAs干扰序列包括:si-CYP4A1、si-CYP4A2、si-CYP4A3。应用流式细胞仪检测ROS，采用Western blot检测各组CYP4A、NOX2、核内NF-κB、p-Akt、Akt、p-JNK、JNK、c-caspase-3、Bcl-xL蛋白表达水平。应用TUNEL法检测各组H9c2细胞凋亡情况。 结果:1.特异性抑制CYP4A对AGEs诱导的小鼠心肌氧化应激损伤的保护作用研究与BSA组相比， AGEs模型组心脏组织中SOD活力明显降低;MDA、H2O2含量明显增高;心肌细胞凋亡增加;CYP4A、NOX2、p-JNK、NF-κB、c-caspase-3蛋白表达明显上调，p-Akt、Bcl-xL蛋白表达明显下调，而AGEs+ HET0016组与AGEs模型组相比各项指标均有明显改善。 2.特异性抑制CYP4A对AGEs诱导的H9c2细胞氧化损伤的保护作用研究 2.1与BSA组相比，AGEs模型组ROS、MDA含量升高;细胞凋亡增多;SOD活力明显降低;CYP4A1、CYP4A2、CYP4A3基因表达显著升高;CYP4A、NOX2、p-JNK、核内NF-κB、c-caspase-3蛋白表达明显上调，p-Akt、Bcl-xL蛋白表达明显下调。给予HET0016后，上述指标均有所改善。 2.2与BSA+si-control组相比，AGEs+si-control组ROS含量升高;细胞凋亡增多;CYP4A、NOX2、p-JNK、NF-κB、c-caspase-3蛋白表达显著上调，p-Akt、Bcl-xL蛋白表达显著下调;与AGEs+si-control组相比，AGEs+si-RNAs组ROS含量降低;细胞凋亡减少;CYP4A、NOX2、p-JNK、核内NF-κB、c-caspase-3表达显著下调;p-Akt、Bcl-xL蛋白表达明显上调。 结论:特异性抑制CYP4A对AGEs诱导的心肌氧化应激损伤具有保护作用，且该保护作用可能与抑制氧化应激及凋亡通路相关。
心肌损伤;氧化应激;晚期糖基化终产物;细胞色素氧化酶P4504A
大连医科大学
硕士
药理学
李华
2016
中文
R542.2
58
2017-01-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）