载蓝萼甲素靶向纳米制剂对乳腺癌细胞及乳腺癌干细胞的体外抗肿瘤活性研究
乳腺癌是中国女性最常见的恶性肿瘤，每年中国乳腺癌的初发数量和死亡数量分别占到全世界的12.2％和9.6％。其中，10-14％的乳腺癌患者被诊断为三阴性乳腺癌，这类乳腺癌具有高有丝分裂率，高度淋巴细胞浸润性，高核分级和肿瘤尺寸大的特征，同时伴有早期诊断时有淋巴结转移，并且约有15％的病人会出现脑转移。近年来大量研究表明，肿瘤干细胞在肿瘤的发展、耐药、复发过程中扮演着非常重要的角色。 针对上述问题，我们提出新的解决方案:采用生物相容性好的载体（纳米脂质体、人血清白蛋白纳米粒）包载中药抗肿瘤成分，将药物被动靶向递送到乳腺肿瘤细胞和乳腺肿瘤干细胞实现对肿瘤的杀伤作用，同时能够降低药物及载体对正常组织的毒副作用。 蓝萼甲素(GLA)是具有多种生物活性功能的二萜类化合物。据报道，GLA可对多种肿瘤起到抑制作用。本课题采用纳米脂质体和人血清白蛋白纳米粒包载GLA，拟通过纳米颗粒的被动靶向作用快速有效杀伤乳腺癌细胞及乳腺癌干细胞。 本文首先采用紫外全波长扫描法确定了GLA的检测波长并通过高效液相色谱法成功建立了GLA的体外检测方法，GLA在7.82～1000μg·ml-1的浓度范围内相关性良好(R2=0.99992)，直线回归方程为A=30910C+86556。GLA在该方法中适应性良好，日内精密度、日间精密度及回收率均符合GLA体外检测要求。为下一步实验奠定了方法学基础。 成功培养、传代、冻存、复苏了MCF-7和sum149PT乳腺癌细胞系，采用无血清培养法成功筛选培养了MCF-7肿瘤球(MCF-7-TS)和sum149PT肿瘤球(sum149PT-TS)两种乳腺癌肿瘤球，并通过CD24/CD44+表面标记物法鉴定了乳腺肿瘤球的干性表达。 通过单因素考察法及正交试验设计方法确定了蓝萼甲素纳米脂质体的最优处方及最优工艺条件，并成功制备出符合理性模型的蓝萼甲素纳米脂质体。通过超滤离心-高效液相色谱法测定包封率和载药量分别为79.19±1.733％和3.43±0.250％;通过马尔文粒径仪对其粒径分布及电位分布进行表征，其粒径为82.58±1.25nm，pdI为0.19±0.009，Zeta电位为-11.86±1.48mV，且粒径与电位分布均一稳定;用透射电镜(TEM)对其形态进行表征，结果表明蓝萼甲素纳米脂质体形态圆整，大小均一分散均匀;通过对比考察游离蓝萼甲素和蓝萼甲素纳米脂质体的释放行为，发现蓝萼甲素纳米脂质体具有更好的缓释作用及稳定性。 通过激光共聚焦验证MCF-7细胞系及MCF-7-TS肿瘤球对纳米脂质体的摄取情况，在4小时内MCF-7细胞系及MCF-7-TS肿瘤球对纳米脂质体的摄取均随时间延长而增加，且纳米脂质体的摄取作用强于游离药物;采用cck-8法评价蓝萼甲素纳米脂质体及空白纳米脂质体对MCF-7和sum149PT细胞系及MCF-7-TS肿瘤球的细胞毒性作用，观察到相同的结果:蓝萼甲素经纳米脂质体包载后对细胞杀伤作用增强且呈时间依赖性而空白纳米脂质体则无毒性作用;通过流式细胞检测技术进一步确定了给予药物处理后，蓝萼甲素纳米脂质体诱导MCF-7和sum149PT细胞系及MCF-7-TS肿瘤球凋亡效果优于游离药物;通过MCF-7细胞系及MCF-7-TS的肿瘤球形成率实验，进一步验证了蓝萼甲素纳米脂质体能够降低肿瘤干细胞的分化与增殖。 采用本实验室专利成功制备了高包封率的载蓝萼甲素人血清白蛋白纳米粒，通过马尔文粒径仪对其粒径及电位分布进行表征，测得粒径为158.33±31.37nm，pdI为0.371±0.90，Zeta电位为-29.20±5.01mV;用TEM对其形态表征，结果显示载蓝萼甲素人血清白蛋白纳米粒形态圆整，大小均一，分散均匀;采用超滤离心-高效液相色谱法测定包封率为89.59±1.77％;对比考察游离蓝萼甲素及载蓝萼甲素人血清白蛋白纳米粒的释放行为，结果显示载蓝萼甲素人血清白蛋白纳米粒具有更好的缓释作用，其在24h、48h和96h的累计释放量为47.37％、62.15％和71.92％，在120h内具有一定缓释效果;通过激光共聚焦观察到MCF-7细胞系和MCF-7-TS对人血清白蛋白纳米粒均有较强的摄取作用;采用CCK-8法测得载蓝萼甲素人血清白蛋白纳米粒对MCF-7细胞系和MCF-7-TS有较强的细胞毒性作用;通过流式细胞检测术进一步确定了载蓝萼甲素人血清白蛋白纳米粒能够诱导肿瘤细胞及肿瘤干细胞凋亡;通过MCF-7细胞系及MCF-7-TS肿瘤球形成率实验，进一步说明载蓝萼甲素人血清白蛋白纳米粒可以有效杀伤乳腺癌干细胞。 综上所述，选择纳米脂质体和人血清白蛋白纳米粒包载蓝萼甲素药物，不仅能够克服蓝萼甲素溶解度差等缺点，提高药物的稳定性，更能够携带药物靶向到肿瘤部位发挥治疗作用，为治疗乳腺癌提供了新的策略。
乳腺癌;肿瘤干细胞;载蓝萼甲素;纳米制剂;抗肿瘤活性
大连医科大学
硕士
药理学
王强
2016
中文
R737.9;R979.1
90
2017-01-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）