CAI对大鼠结肠炎的药理作用及作用机制探讨
目的： 炎症性肠病（inflammatory bowel diseases，IBD）是一种慢性、复发性的肠道炎症性疾病，包括克罗恩病(Crohn's disease，CD)和溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis，UC)，在世界范围内的发病率和致死率均呈逐年上升趋势，但它的确切病因及具体病理机制仍未清晰。氨基水杨酸类、糖皮质激素、免疫抑制剂以及生物制剂是目前临床上用于治疗IBD的主要药物，但是它们由于长期应用副作用大、仅对部分患者有效、疗效不稳定或价格昂贵等原因，在使用时受到一定的限制。因此，寻找新型IBD治疗药物意义重大。 羧胺三唑（carboxyamidotriazole，CAI）是一种非细胞毒类抗癌药物，在体内外模型中均显示出抑制肿瘤细胞增殖及转移的作用，并且还可以抑制血管新生。此外，本课题组通过动物实验已证实，CAI在一系列急、慢性炎症模型及自身免疫性疾病模型中均显示出良好的抗炎效果。在这些模型中，CAI可以明显降低实验动物炎症部位和血清中促炎细胞因子的水平，而这些细胞因子过分表达对IBD的发病与病理改变具有重要影响，同时它们的表达受到NF-κB和NLRP3炎症体激活的双重影响。因此，我们建立了TNBS诱导的大鼠化学诱导性结肠炎模型，来探讨CAI对结肠炎的治疗效果和其是否是通过调控NF-κB和NLRP3炎症体激活而发挥作用。 方法： 采用TNBS诱导的大鼠化学诱导性结肠炎模型，观察并测试大鼠体重、粪便和便血情况，从疾病活动指数（DAI）评分、宏观评分、病理组织学评分和各种炎症相关评价指标，如MPO活性及lipocalin-2水平等方面评价CAI的治疗效果。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测造模7天后大鼠结肠组织与血清内各种细胞因子含量，包括TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-18和TGF-β的水平。采用RT-qPCR法检测mRNA水平上NLRP3、ASC和caspase-1的含量。采用Western blot法或免疫组织化学方法测定蛋白水平上NF-κB信号通路与NLRP3炎症体中各因子含量，包括NF-κBp65、IBα与p-IκBα、NLRP3、ASC、pro-caspase-1与caspase-1、IL-1β与IL-18的前体和成熟体蛋白的表达。 结果： 1.80mg/kg的TNBS-50％乙醇溶液可以成功诱导大鼠化学诱导性结肠炎，其肠道改变与CD的病理变化相似。模型大鼠表现为肠腔狭窄，肠壁增厚，黏膜充血、水肿、溃疡或肉芽肿形成，黏膜炎症细胞浸润（以中性粒细胞为主）、隐窝结构破坏和杯状细胞缺失等。 2.CAI(10、20、40mg/kg)可以显著改善模型大鼠体重降低情况及DAI评分。CAI(20、40mg/kg)可以显著改善脾大、结肠长度缩短情况，降低动物宏观评分与组织学评分。CAI(40mg/kg)能够降低实验动物结肠重量的增加。 3.整体观察时可见CAI(20、40mg/kg)组大鼠结肠充血、肠结节、肠壁增厚等症状显著缓解，黏膜破损范围较小;组织学观察时可见CAI(10、20、40mg/kg)组大鼠黏膜损害累及范围缩小，中性粒细胞浸润、杯状细胞缺失以及隐窝结构破坏程度明显减轻。 4.与正常对照组相比，溶剂对照组大鼠肠组织中的MPO活性及血清中的lipocalin-2水平等炎症相关指标明显上调(P＜0.01)，同时肠道通透性增加，血清中的FITC-dextran水平升高。经CAI治疗后，MPO活性、lipocalin-2和FITC-dextran水平均降低，肠道通透性明显下降。 5.与正常对照组相比，TNBS诱导的大鼠结肠组织匀浆中的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-18和TGF-β水平和血清中的TGF-β水平均显著升高(P＜0.01)，经CAI治疗后降低，且具有统计学差异。 6.Western Blot的检测结果显示，与正常对照组相比，TNBS诱导的大鼠结肠组织内IL-1β及IL-18前体及成熟体蛋白含量均升高(P＜0.01)，经CAI治疗后，pro-IL-1β、IL-1βp17、pro-IL-18和IL-18 p18四种蛋白的表达均明显降低。 7.免疫组化的检测结果显示，正常对照组大鼠结肠组织内NF-κ p65表达很少，多见于细胞胞浆内。经TNBS诱导后，NF-κB p65的阳性表达显著上调(P＜0.01)，并且多见于细胞核。经CAI治疗后，NF-κB p65阳性表达明显下调，细胞核与胞浆内的染色程度均降低。 8.Western Blot的检测结果显示，与正常对照组相比，TNBS诱导的大鼠结肠组织内p-Iκ Bα的水平明显上调，而IκBα的水平明显降低（均P＜0.01）。CAI能够显著抑制TNBS引起的大鼠结肠组织内IBα降解及p-IκBα水平的上调。 9.RT-qPCR的检测结果显示，与正常对照组相比，TNBS诱导的大鼠结肠组织内NLRP3和caspase-1的mRNA水平显著上调（均P＜0.01），经CAI治疗后明显降低，而ASC的mRNA水平在各组间未发生明显改变。 10.Western Blot和免疫组织化学的检测结果均显示，与正常对照组相比，TNBS诱导的大鼠结肠组织内NLRP3和caspase-1的蛋白含量明显升高（均P＜0.01），经CAI治疗后降低，而ASC的蛋白表达水平在各组间未发生明显改变。 结论： CAI对TNBS诱导的大鼠结肠炎有较好的治疗效果。整体水平与组织细胞水平的研究显示，CAI可以改善模型大鼠疾病严重程度，抑制肠黏膜炎性反应，保护和维持肠道的完整性，在临床症状和病理改变方面抑制并缓解结肠炎的发展。我们认为，CAI的治疗作用与其较强的抗炎能力有关。CAI能够抑制促炎细胞因子产生，如降低组织中升高的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A以及IL-18的含量。CAI对组织和血清中TGF-β的表达水平也有下调作用，提示CAI可能有抗纤维化的作用，可以减缓结肠组织中胶原纤维的沉积。同时，CAI能够抑制NF-κB信号通路以及NLRP3炎症体激活，从而减轻肠道炎性损害，改善多种炎症症状。综上所述，我们可以推测，CAI可作为一种口服治疗IBD的潜在的候选药物。
结肠炎;羧胺三唑;抗炎作用;实验药理
北京协和医学院;中国医学科学院;清华大学医学部;北京协和医学院中国医学科学院
硕士
药理学
叶菜英
2016
中文
R574.62;R965
100
2016-11-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）