MET-PI3K-Akt信号通路介导miRNA-31调控肺腺癌肿瘤干细胞功能
肺癌是发病率和致死率都很高的恶性肿瘤，其中80％的肺癌是非小细胞肺癌。非小细胞肺癌包括腺癌、鳞状细胞癌和大细胞肺癌等分型，而肺腺癌是最主要和常见的亚型。几乎所有的非小细胞肺癌都会在治疗的2-3年内产生耐药，而导致非小细胞肺癌病人死亡的另外一个主要原因是肺癌出现转移。肿瘤干细胞(CSCs)是一组能够自我更新、分化的肿瘤细胞，这些细胞被确定为肿瘤的起源，通过对称或不对称分裂扩大干细胞池从而产生所有肿瘤细胞类型。近年的研究结果表明CSCs是肺癌因耐药而复发和转移的一个重要因素。因此，发现和发展抑制CSCs的治疗性药物有可能改善临床治疗现状。 microRNA(miRNA，miR)是内源性非编码RNA，可以通过抑制翻译和降解信使核糖核酸（mRNA）来调节基因的表达。有研究表明，一半的肿瘤在发生过程中存在miRNA的基因突变，表明miRNA与肿瘤的发生发展密切相关。另外，正常组织和肿瘤细胞的miRNA表达差异分析结果表明miRNAs的表达是评价疾病进程和临床结果的良好指征，且多个研究结果提示，某些miRNAs在非小细胞肺癌的发展中发挥着特定的作用。 在本研究中，我们发现miRNA-31(miR-31)在正常肺组织、肺腺癌细胞和肺腺癌干细胞中的表达明显不同，提示miR-31可能具有靶向调控肺腺癌特别是肺腺癌肿瘤干细胞功能的作用，为此我们进行了一系列实验用于探索miR-31对肺腺癌干细胞的作用及相关机制。 第一部分 肺腺癌肿瘤干细胞中异常表达miR-31对肿瘤干细胞的调控作用 1.提取正常肺细胞、肺腺癌A549细胞、肺腺癌A549CD133+细胞中的RNA，利用安捷伦人源miRNAV3微列阵芯片检测这三种样本中miRNAs的表达，选取表达差异显著的3个miRNAs(miR-31、miR-194和miR-451)进行芯片检测。通过real time-PCR(实时定量PCR)方法验证微列阵芯片结果，发现在这两次试验中，miR-31的表达水平一致，在A549CD133+细胞中表达最高，在正常肺组织中miR-31水平低于芯片检测线，在A549细胞中表达高于正常肺组织，低于肿瘤干细胞; 2.构建得到miR-31过表达慢病毒载体(pMIRNA1-miR-31)和功能缺失慢病毒载体(pll3.7-miR-31-sponge)，包装成慢病毒后感染A549CD133+细胞，稳定转染的MiR-31-knockdown对照细胞(A549CD133+-eGFP cells)、MiR-31-knockdown细胞(A549CD133+-sponge cells)、MiR-31过表达对照细胞(A549CD133+-copGFPcells)和MiR-31过表达细胞(A549CD133+-miR-31 cells)。检测这些细胞中miR-31的含量，结果显示MiR-31-knockdown细胞的miR-31的含量相对于其对照组降低了80％，而MiR-31过表达细胞的miR-31的含量相对于其对照细胞升高一倍; 3.体外细胞增殖实验检测MiR-31-knockdown对照细胞、MiR-31-knockdown细胞、MiR-31过表达对照细胞和MiR-31过表达细胞的生长活性，结果显示miR-31高表达能显著抑制肺腺癌肿瘤干细胞的增殖活性; 4.采用流式细胞仪测定分析细胞周期。实验结果表明MiR-31-knockdown细胞从G1/G0期进入S期的比例相对于对照细胞明显增加;而MiR-31过表达细胞G1/G0期细胞比例明显高于MiR-31过表达对照细胞，表明miR-31促进A549CD133+细胞周期阻滞，进入分裂期的细胞比例降低; 5.采用流式细胞仪测定分析各组细胞的凋亡和坏死比例。结果显示分别相对其对照组，MiR-31-knockdown细胞的凋亡和坏死比例明显减少，而MiR-31过表达细胞的凋亡和坏死比例却明显增加; 6.整体动物实验评价miR-31对肺腺癌肿瘤干细胞在体发生和生长的抑制作用。统计各组小鼠肿瘤发生的时间。结果表明，当肺腺癌肿瘤干细胞中miR-31表达水平降低时，肿瘤更易形成;而肿瘤体积-时间曲线和实验终点肿瘤重量的结果也表明肺腺癌抑制肿瘤干细胞中miR-31的表达能够显著促进肿瘤的生长;肺腺癌肿瘤干细胞形成肿瘤后，给予miR-31长效模拟物(MiR-31 Agomir)可以有效地抑制肿瘤的扩增并杀伤肿瘤; 7.对模型小鼠和给药小鼠进行病理学分析。对肿瘤组织进行HE染色、PCNA染色和TUNEL染色，结果证明MiR-31 Agomir(Agomir-31)具有显著的杀伤肺腺癌的作用。 第二部分 MiR-31调节肺腺癌干细胞的作用机制研究 1.应用生物信息学软件预测miR-31的靶基因，利用real time PCR初步筛选，抑制miR-31的水平，MET、Ret、PIK3C2A和GRB10基因的mRNA水平和蛋白水平均显著升高; 2.利用双荧光素酶报告基因验证MET、Ret、PIK3C2A和GRB10基因与miR-31的直接结合。结果显示在转染野生型报告基因载体的细胞中，给予miR-31模拟物(mimics)后，细胞的相对荧光值显著降低，而在转染突变型报告基因载体的细胞中，给药组细胞和对照组细胞的相对荧光值并没有显著差别，证明MET、Ret、PIK3C2A和GRB10是miR-31的直接靶基因; 3.成功构建MET knockdown（基因敲低）的慢病毒(sh-MET)，感染至A549CD133+细胞后筛选得到稳定的MET基因敲低的细胞株，即A549CD133+-sh-MET细胞和A549CD133+-sh-NC细胞，利用real time PCR（实时定量）和western blot方法检测细胞内MET的表达，结果显示sh-MET可以降低细胞内的MET mRNA含量至60％，同时使MET蛋白表达降低了40％; 4.体外细胞增殖实验检测A549CD133+-sh-MET细胞和A549CD133+-sh-NC的生长活性，结果显示A549CD133+-sh-MET细胞的增殖活性显著降低;流式测定细胞周期，结果表明MET的表达被抑制后，细胞从G1/G0期进入S期和G2/M期的比例显著减少; 5.整体动物实验评价MET对肺腺癌肿瘤干细胞在体肿瘤发生和生长的作用。根据各组小鼠的肿瘤体积-时间曲线和终点肿瘤重量的测定结果，MET基因功能缺失肺腺癌肿瘤干细胞接种形成的肿瘤的生长被显著抑制; 6.Western blot检测细胞和小鼠肿瘤组织内增殖、周期和凋亡相关调控蛋白的表达。结果显示miR-31表达增加或MET功能缺失都会抑制肿瘤细胞和组织内PI3K、Akt、P-Akt、CDK2和Bax蛋白的表达并上调Bcl-2，表明miR-31靶向MET进而介导PI3K-Akt信号通路调节A549CD133+细胞的生长活性。 综上所述，本研究筛选出A549CD133+细胞中异常表达的miR-31，并发现miR-31在肿瘤干细胞中的表达不同可以显著影响肿瘤干细胞包括增殖、周期、凋亡等在内各种生长活性。miR-31下调显著促进肿瘤干细胞的生长活性和在体形成肿瘤;反之，miR-31上调可以抑制肿瘤干细胞的生长。深入探讨后发现miR-31通过靶向MET等原癌基因并激活PI3K-Akt生长信号通路发挥抗肿瘤作用。该研究发现miR-31具有抵抗肿瘤干细胞生长的潜力，从而为miRNA靶向肿瘤干细胞抑制人肺腺癌的治疗策略提供了实验依据。
非小细胞肺癌;肿瘤干细胞;微小核糖核酸1;磷脂酰肌醇-3-激酶;蛋白激酶B
北京协和医学院;中国医学科学院;清华大学医学部;北京协和医学院中国医学科学院
博士
药理学
叶菜英;左萍萍
2016
中文
R734.2;R730.2
128
2016-11-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）