八宝丹对小鼠急性酒精性肝损伤的干预作用及其机制研究
目的: 急性酒精性肝损伤(acute alcoholic liver injury)是指短期内大量饮酒导致肝脏损伤的疾病，是世界性的公共卫生问题，其患病率和发病率呈逐年上升趋势。酒精性肝病发病机制复杂，与氧化应激、免疫反应、多种细胞因子和自噬等有关。近年来，对酒精性肝病发病机制和治疗方法的研究虽然取得了一定进步，但是迄今为止尚无特效治疗方法。 微环境的稳定是保持细胞生长、增殖、功能和代谢的重要因素。急性酒精性肝损伤的发生发展与肝细胞微环境（如氧化还原状态）的改变密切相关。机体大量饮酒后会引起肝细胞的微环境发生明显改变。酒精进入机体后，经肝脏代谢释放出的过氧化氢(H2O2)及超氧阴离子(O2-)能够促使ROS(Reactive oxygen species，ROS)的聚集，引起氧化应激反应。同时，酒精诱导产生的CYP2E1(cytochrome P450 family2，subfamily E，polypeptide1)，能够调节和激活毒性物质相关反应并进一步促使ROS聚集，参与脂质过氧化作用，从而促进肝细胞损伤。在酒精性肝损伤过程中，乙醇代谢产物和ROS的毒效应均会导致细胞凋亡和坏死，不仅能引起肝细胞形态的改变、脂肪变性，而且还造成其它组织器官的损伤。随着对急性酒精性肝损伤研究的深入，以改善微环境为策略的治疗研究备受关注。然而，由于微环境具有多样的生物特性以及复杂的组织结构，单通过调控其中某一基因或某一类相关细胞难以获得理想的疗效。 中药具有多效性和多向调节的特性，得到了国内外的广泛认可。八宝丹是我国重要的保护类中药，在临床上用于防治多种肝胆类疾病（如传染性病毒性肝炎、急性胆囊炎、重型病毒性肝炎等），且疗效显著，但八宝丹治疗酒精性肝损伤的相关研究未见报道。八宝丹主要是由牛黄、蛇胆、羚羊角、珍珠、三七、麝香等八种药材组成，内含多种有效成分，如牛磺酸、麝香酮、牛磺胆酸、皂苷及黄酮类。这些有效成分协同作用，治疗疾病。 八宝丹在临床上治疗肝胆炎症有明确疗效，且急性酒精性肝损伤的发生发展与肝细胞的微环境变化密切相关。因此我们推测，八宝丹可能通过改善肝细胞的微环境抑制急性酒精性肝损伤的发生发展。本课题利用小鼠急性酒精性肝损伤模型，给予八宝丹处理，检测血清肝功能相关指标谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和甘油三酯(TG);并采用HE染色、油红染色、CCK8、氧化敏感探针(DCFH-DA)染色、Western blotting、Real-time PCR以及转染si-RNA等实验技术方法研究和探讨八宝丹在急性酒精性肝损伤过程中的作用及其机制。 方法及结果: 第一部分:构建小鼠急性酒精性肝损伤模型并给予八宝丹灌胃处理，观察小鼠醉酒情况、检测血清中肝功能相关指标的变化如ALT、AST、TG的水平，HE染色和油红染色检测肝脏脂肪变性的程度。利用CCK8实验方法检测不同分组中AML-12细胞的增殖活性。实验结果显示八宝丹对急性酒精性肝损伤具有显著的保护作用。而且八宝丹的保护作用具有剂量依赖性:在一定的浓度内，随着八宝丹剂量地增加，其对肝损伤的保护效应逐渐增大。 第二部分:采用DCFH-DA染色方法检测八宝丹对肝细胞ROS的表达;利用Real-time PCR和Western Blotting实验方法检测肝细胞中CYP2E1、Nrf2、HO-1、GCLC基因的表达;相关试剂盒检测肝细胞中MDA、ADH、SOD、GSH、CAT、GPx水平，利用siRNA技术和抑制剂干扰肝细胞中Nrf2的表达观察八宝丹对急性酒精性肝损伤的影响。实验结果显示八宝丹能够抑制了CYP2E1的分泌、减少ROS的合成进而减少了脂质过氧化物MDA的生成，从而降低酒精对肝细胞氧化损伤的作用;Nrf2的激活促进抗氧化剂的合成，如GSH和SOD等，从而提高了对肝细胞的保护效应。 结论: 本课题研究表明八宝丹对急性酒精性肝损伤具有保护作用且具有剂量依赖性，其作用机制是:一方面抑制CYP2E1的表达，另一方面能够启动Nrf2基因及其下游基因序列的表达，从而抑制氧化应激作用和促进相关抗氧化物的生成。
急性酒精性肝损伤;八宝丹;肝功能指标;药理活性
第二军医大学
硕士
药理学
张黎
2016
中文
R575;R285.5
64
2016-11-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）