基于生物条形码末端延伸技术的电化学生物传感器
基于肿瘤生物标志物分子（如肿瘤相关DNA和蛋白质）的诊断技术在肿瘤的早期诊断中具有重要意义，与常用的肿瘤诊断方法比可更早实现诊断。然而这些生物标志物在临床样本中的含量极低，因此，开发灵敏度高和特异性强的检测技术很有必要。电化学生物传感器具有快速、高效、高灵敏度、构造简单、易于操作、便于小型化和规模化等优点，具有早期快速诊断的潜力，因此备受关注。为提高生物标志物的检测灵敏度，本论文设计和研究了基于核酸末端延伸放大技术的电化学DNA传感器和适体传感器。具体内容如下: 一、基于核酸末端延伸放大的电化学DNA传感器 构建了纳米生物条形码，结合核酸末端延伸反应和氧化还原酶对DNA检测信号进行放大，实现了目标DNA的高灵敏度检测。纳米生物条形码由金纳米粒子和5'端巯基标记信号探针组装而成。当目标DNA存在时，组装在金电极表面的3'端巯基标记捕获探针、目标DNA和纳米生物条形码结合形成夹心结构，然后在信号探针DNA的3'端以生物素标记dATP为底物进行末端延伸反应，延伸的长链上标记的生物素可与亲和素标记辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)结合，通过检测HRP催化底物产生的电化学信号可以实现目标DNA的高灵敏检测。条件优化后该传感器检测下限低于10fmol/L，检测范围达到9个数量级，具有较高灵敏度，能够识别单个碱基错配，并且在血清模拟样本中也有较高的检出率。 为了更进一步提高电化学DNA传感器的性能，利用末端延伸酶构建超分子DNA网，并以此实现了DNA的高灵敏度检测。组装在金电极表面的捕获探针捕获目标DNA后能提供3'末端，在末端延伸酶的催化作用下以生物素标记dATP为底物进行末端延伸反应，然后将末端延伸的长链与支链DNA进行杂交反应并提供更多3'末端，交替进行末端延伸和支链杂交过程，在多次循环结束后加入亲和素标记HRP，检测HRP催化底物产生的电化学信号可以实现目标DNA的高灵敏检测。所设计的超分子DNA网上布满生物素，对DNA的检测下限达到10fmol/L，在10fnol/L-100pmol/L的检测范围内呈线性，并且能够识别单个碱基错配，具有较好的血清样本检出率。 二、基于核酸末端延伸放大的电化学适体传感器 构建了双核酸适体夹心法的电化学适体传感器，利用核酸末端延伸技术和氧化还原酶对癌胚抗原(Carcinoembryonic Antigen，CEA)检测信号进行放大。两条核酸适体可同时与CEA结合形成夹心结构，其中一条通过3'端巯基标记组装在金电极表面可特异性捕获CEA，另一条为未修饰的核酸适体信号探针;然后在核酸适体信号探针3'末端进行延伸反应，延伸出标记多个生物素的长链与亲和素标记HRP结合，检测HRP催化底物产生的电化学信号实现CEA的定量检测。该传感器对CEA分子的检测下限低于10pg/mL，检测范围达到了6个数量级，并且具有较高的选择性和血清模拟样本检出率。 在上述工作基础上，构建基于纳米生物条形码和核酸末端延伸技术的电化学适体传感器，进一步提高CEA的检测灵敏度。5'端巯基标记的核酸适体信号探针通过金-硫键自组装到金纳米粒子表面而形成纳米生物条形码。组装在金电极表面的3端巯基标记核酸适体捕获探针、CEA和纳米生物条形码形成夹心结构，然后在核酸适体信号探针的3'端进行延伸反应生成多条标记生物素的长链DNA，结合亲和素标记HRP，检测HRP催化底物产生的电化学信号可以实现CEA的检测。所构建的传感器实现了CEA的高灵敏度检测，检测下限低于100fg/mL，检测范围达到了8个数量级，并且具有较好的选择性和血清模拟样本检出率。
电化学生物传感器;纳米生物条形码;末端延伸技术;生物标志物;检测灵敏度
南京理工大学
硕士
生物化工
杨树林;万莹
2016
中文
TP212.3
86
2016-11-11（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）