地磷莫司抑制同种异体器官移植免疫排斥作用及机制研究
目的:器官移植是解决终末器官衰竭的最佳途径之一，心脏移植与胰岛移植已分别应用于各自临床领域，并起到不错的效果。但是临床应用中遇到最大的问题就是免疫排斥问题，自身的免疫排斥导致移植器官过早的衰竭而失去功能，出现一系列生理问题，无法正常生活，严重影响到移植后患者的生命和器官移植在临床的应用。为了抑制免疫，保护移植器官，延长移植物生存期，延长终末期疾病患者的生命，临床上已应用多种免疫抑制剂，但是因为其价格昂贵，毒副作用强等原因阻碍了其在临床的应用，因此开发新型的毒副作用小的免疫抑制剂具有重要的意义。作为首例丝氨酸/苏氨酸激酶mTOR结合药物，雷帕霉素在临床的应用己得到公认，其结合mTOR可以控制细胞代谢、增殖、分化，同时也是抗癌的一个重要机制。但是由于雷帕霉素的水溶性较弱、半衰期长、化学稳定性较弱，其在器官移植领域的应用中受到了限制，使其无法达到器官移植免疫抑制的有效浓度。雷帕霉素的C40是一个理想的药物化学改变位点，C40远离FKBP12和mTOR的主要结合位点，对其进行二甲基磷酰化，得到具有高溶解性、高稳定性、高生物利用度等优点的地磷莫司。地磷莫司的诸多优点使其得到FDA快速批准应用于软组织与骨肉瘤的治疗，其关于治疗血液癌（淋巴瘤和白血病）的二期临床试验已经完成，子宫内膜癌的二期临床试验也已展开。而其关于免疫抑制作用的研究未见报道。为了开发其在器官移植领域的应用，我们拟借助胰岛移植、心脏移植模型以及体外实验，研究其免疫抑制机制，为地磷莫司进一步进行临床试验打下基础，为其能顺利应用于临床器官移植做好铺垫。 方法:我们首先在体外实验中研究地磷莫司的免疫抑制作用及其作用机制。采用混合淋巴细胞培养、淋巴细胞转化实验等确定其具有免疫抑制作用，再用凋亡实验、克隆无能实验、CFSE、ELISA等探讨地磷莫司的免疫抑制作用机制及其影响细胞分泌的炎性因子情况;其次，我们建立了小鼠胰岛移植模型和小鼠心脏移植模型，研究地磷莫司保护移植物、延长移植物生存期的作用;最后，我们通过对受体鼠体内移植物病理切片、供者特异性抗原引起的免疫应答能力、T细胞亚群、调节性T细胞等进行分析，试图阐明地磷莫司抑制同种异体器官移植免疫排斥反应，延长移植物生存期的机制，以此来分析其作为免疫抑制剂应用于器官移植的可行性。 结果:在体外实验中，我们首先运用淋巴细胞转化实验确定了地磷莫司可以抑制淋巴细胞/T细胞的增殖，我们用供体特异性抗原（Balb/c细胞）刺激受体细胞增殖实验验证了地磷莫司在体外可以抑制供体特异性抗原刺激的细胞增殖，且地磷莫司浓度为1ng/mL的时候已达到最佳的抑制增殖效果;我们运用CFSE标记的方法验证了地磷莫司可以同时抑制CD4+/CD8+T细胞的供体特异性抗原刺激的增殖，且对CD4+T细胞的抑制效果更显著;我们用流式检测了地磷莫司对淋巴细胞/T细胞凋亡的影响，发现地磷莫司不会引起淋巴细胞/T细胞的凋亡;我们做了克隆无能实验，外源IL-2(100U/mL)可以恢复地磷莫司抑制的T细胞的增殖能力，说明克隆无能是地磷莫司诱导免疫耐受的机制之一;通过对T细胞分泌的细胞因子的检测发现，地磷莫司抑制了Th1型细胞因子（IL-2/IFN-γ）的分泌，同时促进了Th2型细胞因子（IL-4）的分泌和TGF-β的分泌;体内实验中，地磷莫司可以延长小鼠同种异体胰岛移植模型/小鼠同种异体心脏移植模型中移植物生存期;由HE切片/生存期我们得出，地磷莫司可以抑制炎症因子浸润、保护移植物，从而延长生存期;由混合淋巴细胞培养实验我们得到，地磷莫司可以抑制经过胰岛移植/心脏移植后的淋巴细胞/T细胞供体特异性免疫应答活性，我们通过CFSE染色的方法得到地磷莫司可以同时抑制CD4+T细胞与CD8+T细胞供体特异性抗原刺激的增殖活性;我们对移植术后的受体小鼠的脾脏T细胞亚群细胞比例的检测得出，地磷莫司抑制了受体小鼠脾脏中CD4+T细胞比例，抑制了受体小鼠脾脏中CD8+T细胞比例，升高了受体小鼠体内CD19+B细胞比例;对受体小鼠脾脏/淋巴结中调节性T细胞比例的分析得到，地磷莫司可以同时提高小鼠脾脏/淋巴结中调节性T细胞比例;对于受体小鼠血清中细胞因子IL-2/IL-4/IFN-γ/TGF-β的ELISA检测可以得出，地磷莫司抑制了受体小鼠血清中细胞因子IL-2/IFN-γ的分泌，提高了受体小鼠血清中细胞因子IL-4/TGF-β的分泌。 结论:通过本课题的研究，我们首次证实了地磷莫司具有免疫抑制作用，可通过抑制增殖，诱导克隆无能，抑制T亚群细胞比例，诱导调节性T细胞，抑制Th1型细胞分子的分泌，促进Th2型细胞分子的分泌等机制减少移植物炎性细胞浸润，保护移植物，延长同种异体胰岛移植/心脏移植移植物生存期。本课题的研究为地磷莫司应用于器官移植领域奠定了基础，进一步促进了地磷莫司走向器官移植临床应用的步伐。
地磷莫司;心脏移植;胰岛移植;免疫抑制;药理活性
厦门大学
硕士
药理学
齐忠权
2016
中文
R979.5
83
2016-10-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）