环境污染物DBP和AFTM1单克隆抗体制备及人体内暴露水平研究
随着科技的进步，经济的发展，环境问题越来越凸显。2013年全国肿瘤登记中心对2010年收集到的肿瘤数据进行审核、整理和分析后发现近几年肿瘤疾病的负担日益严重，特别提到与环境相关的健康问题应作为焦点进行跟踪监测。作为导致重要疾病的因素之一，环境问题受到越来越多人的关注与重视。 之前对环境污染物质检测的研究大多是针对大气、土壤、食物等外环境的监测，这些数据可以间接反映小分子环境污染物的主要暴露来源，从源头控制人类过多的暴露。直接对人体尿样、血样等生物样本中的环境污染物质进行内暴露检测能够客观的反映个体内暴露水平，避免个体差异的影响;更有效的预测、预防特定环境污染物暴露剂量对人体危害;同时可以为环境管理者在研制有害物质及致癌环境卫生学标准、提出环境中有害化学物及致癌物的可接受浓度时提供科学理论依据，进而指导国家卫生部门制定更有效的政策，提高国民的健康状态。 目前针对小分子环境污染物的检测方法有仪器分析法和免疫学分析方法两种，传统的仪器分析法（HPLC、GC-MS等）不仅操作复杂，价格昂贵，通量低而且耗时长、灵敏度低，这些缺点限制了其在普通人群中的应用与普及。免疫学的方法采用抗原抗体特异性结合的原理进行检测。目前由于小分子环境污染物质完全抗原的质量低、抗体的特异性差以及方法的灵敏度低、通量低等严重的阻碍了小分子环境污染物质检测技术的发展与应用。 本研究在通过细胞融合技术、高强度多次的亚克隆筛选到特异性好、效价高的单克隆抗体的基础上，建立一种灵敏度高、通量高且操作简便的检测方法，使其能够适用于大批量环境污染物邻苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate，DBP)和黄曲霉毒素M1(Aflatoxin M1，AFTM1)内暴露样本的检测。绝大多数小分子环境污染物分子量小，只具有反应原性，而不具有免疫原性，因此针对同一小分子环境污染物需要首先合成2种不同的人工完全抗原作为免疫原和包被原，再选择制备亲和力高的特异性抗体，建立、优化检测方法后，对浙江省普通人群体内的DBP和AFTM1进行检测分析，获得该人群内暴露水平的第一手资料。 一.两种小分子环境污染物人工完全抗原的制备与获得 小分子环境污染物如邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、黄曲霉毒素M1(AFTM1)，分子量分别为278.34与328，这类物质分子量小、结构简单，必须与载体蛋白结合制备人工完全抗原后才能有效的刺激动物体内产生特异性的抗体。常用的载体蛋白有牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵血清白蛋白(OVA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)及多聚赖氨酸(PLL)。偶联臂的应用可以使得半抗原远离大分子载体，避免小分子半抗原被载体大分子遮盖影响其免疫原性，更好的刺激免疫系统。目前应用的连接臂原形有酸酐、碳二亚胺、戊二醛等。根据半抗原的结构基团，分子中含有羧基和可羧化的半抗原可使用混合酸干法与碳二亚胺法，戊二醛法与重氮化法用于含有氨基或者可还原硝基半抗原的小分子偶联，而含有羟基的半抗原可采用琥珀酸酐和羰基二咪唑作为偶联臂。 针对DBP小分子环境污染物，该研究选用BSA与OVA作为偶联载体。在4-硝基邻苯二甲酸的基础上，首先创新型的选择催化剂进行酯化合成4-硝基邻苯二甲酸二丁酯，然后选择最优的还原剂还原得到具有氨基结构的4-氨基邻苯二甲酸二丁酯，最后通过重氮化反应偶联蛋白载体获得2种人工完全抗原。DBP-BSA作为免疫小鼠的免疫抗原，DBP-OVA作为建立方法的包被抗原。优化实验条件后，该合成方法较文献中的方法产率提高，合成时间缩短。AFTM1-BSA和AFTM1-OVA的2种小分子环境污染物人工完全抗原则通过购买获得，前者作为免疫抗原，后者作为包被抗原。 二.两种小分子环境污染物单克隆抗体的制备与检测方法的建立 来自于同一株细胞的单克隆抗体比来自于不同只动物获得的多克隆抗体相比，具有更高的特异性、更好的均一性并且可以体内外大量制备，其来源和产量丰富等优点。因此我们采用经典的细胞融合的方法筛选得到阳性杂交瘤细胞并通过体内培养、体外纯化获得足量的单克隆抗体。继而通过优化包被抗原浓度、抗体浓度与抗体稀释液等多个条件建立最优化的间接竞争ELISA(indirect completeenzyme-linked immunosorbent assay, Ic-ELISA)检测方法。 在竞争ELISA的方法中，采用制备得到的DBP-BSA抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合后经4次筛选得到杂交瘤阳性细胞株，然后体内大量制备单克隆抗体。在0.25 ug/ml的抗原包被浓度下，采用0.1％明胶稀释液稀释抗体16000倍，该方法灵敏度最高:IC50=7.34 ng/ml，线性范围为0-50 ng/ml，R2=0.994，最低检测限为0.06 ng/ml，变异系数范围为5.93-11.09％，回收率范围97.8-114.3％。同时与GC-MS传统仪器分析法相关性良好，且较文献中其它各种方法相比，具有更强的特异性、更高的灵敏度、更好的精密度和准确度。 依托筛选得到的阳性杂交瘤细胞制备AFTM1单克隆抗体，优化ELISA实验后最佳包被抗原浓度为0.5 ug/ml，抗体稀释2000倍，方法的最低检测限为4 ng/L，IC50为0.36 ng/ml，可接受变异系数和回收率分别为1.788-8.678％，94.21-102.3％。该方法比其他文献检测方法相比，具有灵敏度高、特异性强等优点。 根据两种小分子环境污染物的的单克隆抗体建立的ELISA方法除了特异性好、灵敏度高、操作简单以外，与仪器分析方法相比极大的提高了检测的通量，可用于大量样本中环境污染物质的检测。 三.两种小分子环境污染物人体内暴露的检测与分析 根据上述建立的方法，对1246个普通人群样本进行DBP和AFTM1内暴露含量的检测，检测数据采用PRISM和SPSS软件进行统计分析。DBP在人体尿样样本中的检出率为72.87％，所有检测样本的几何平均值为3 ng/ml。女性、中年组和低教育程度的人群分别较男性、老人组和高教育组人群含量高。AFTM1的检测范围为0.0004094-0.9284 ng/ml，检出率和几何平均值分别为83.01％与0.09229 ng/ml。通过性别、文化程度与年龄分析，结果显示男性、中年组和低教育人群含量较高。
环境污染物;内暴露检测;人工完全抗原;单克隆抗体;细胞融合
浙江大学
硕士
药学
陈枢青
2016
中文
R114;X50
94
2016-09-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）