水稻白叶枯病菌PXO99A中tal4基因功能研究
由稻黄单胞水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)引起的白叶枯病是一种最具破坏性的水稻细菌病害。类似转录激活子效应蛋白(Transcription activator-likeeffector，TALE)是Xoo在侵染植物后通过三型泌出通道泌出的一类蛋白，TALE的编码基因称为tal基因。根据基因组序列，Xoo菌株PXO99A基因组中含19个tal基因。tal4是其中一个功能未知的基因。 本研究中采用基于同源交换的基因敲除方法构建了PXO99A tal4基因的缺失突变菌株，并对该基因缺失突变菌株进行功能互补。通过研究tal4基因缺失突变菌株在寄主水稻上的毒力，对温度、盐、酸碱等胁迫的反应及对杀菌剂敏感性变化来解析tal4基因的功能，并对tal4基因抗药性机制进行了初步探究。 首先通过重叠延伸PCR的方法构建了用于tal4缺失突变的重组体ptal4-KD，将其导入PXO99A后，筛选抗卡那霉素的PXO99A转化子。利用PCR验证法筛选发生双交换的缺失突变菌株PXO99△tal4。将PXO99A中的tal4编码基因的粘粒通过冷冻转化法转入PXO99△tal4中，获得tal4基因缺失突变菌株的功能互补菌株C-△tal4。 PXO99△tal4接种寄主植物水稻后，形成的病斑长度及在水稻中的增殖能力与PXO99A、C-△tal4相比无显著性差异。PXO99△tal4对温度、盐和酸碱等胁迫的反应也没有被改变。而在喷施噻枯唑的水稻上和含噻枯唑的NA平板上，PXO99△tal4对噻枯唑的敏感性较PXO99A明显增强，噻枯唑对PXO99△tal4的最低抑制浓度(MinimalInhibitory Concentration，MIC)为70μg/mL，显著低于对PXO99A的最低抑制浓度110μg/mL;噻枯唑对PXO99△tal4的抑制中浓度EC50值是PXO99A的77.9％。tal4基因可以恢复PXO99△tal4对噻枯唑的敏感性至PXO99A水平。 通过实时荧光定量PCR检测菌株中与抗药性相关的核糖体RNA16S(RibosomalRNA16S，rrs)和30S核糖体蛋白S12(30S ribosomal subunit protein S12，rpsL)基因的表达情况。与PXO99A相比，tal4基因缺失后Xoo中rrs的表达量显著下降，仅为PXO99A的38％，而rpsL基因的表达量与PXO99A没有显著差异。采用同源双交换的方法敲除了PXO99A中rrs基因，rrs基因缺失突变菌株PXO99△rrs表现出对噻枯唑敏感性增强的表型。 上述结果研究表明:tal4基因缺失不影响PXO99A在水稻上的毒力和对温度、渗透压及酸碱胁迫的反应;tal4基因在PXO99A对杀菌剂噻枯唑的抗性中起重要作用;tal4基因突变导致PXO99A中抗药相关基因rrs的转录水平发生显著性变化;tal4基因可能是通过影响菌株中抗药基因rrs的表达来影响菌株对噻枯唑的抗性。本研究首次发现水稻白叶枯病菌效应蛋白基因tal参与了病原菌对杀菌剂噻枯唑的抗药性。
水稻白叶枯病菌;tal4基因;抗药性能;药物敏感性
南京农业大学
硕士
植物病理学
宋从凤
2014
中文
S435.111.47
90
2016-08-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）