利用重组大肠杆菌高效合成S-腺苷蛋氨酸的研究
S-腺苷蛋氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)，又名孓腺苷甲硫氨酸，在生物体内广泛存在，它的重要性仅次于ATP，是一种重要的生理活性物质，具有转甲基、转硫基、转氨丙基等作用，与核酸、蛋白质、磷脂质、神经递质以及维生素的合成紧密相关，并且它对肝病、抑郁症和关节炎等疾病有明显的治疗效果。 目前，SAM价格高昂且不能被广泛用于临床的原因，主要是因为其活力不足且不稳定，且只有(S，S)-SAM，也就是(-)-SAM才具有生物活性。SAM在我国的研究开发较晚，肝病和关节炎患者的市场需求又十分巨大。因此，利用合适的制备方法来提高SAM的产量，使其可以得到工业化大规模生产的意义非常大。 化学合成法、酶促转化法和发酵法这三种方法是SAM的主要生产方法。化学合成法产率低下，且底物又十分昂贵，况且从产物中分离出有活性的SAM比较困难，所以不用这类方法。酶促转化法在一定程度上提高了SAM合成酶的酶活，而且产物的无污染和纯度高等特点，体现了它的优势，但SAM合成酶在体内浓度较低，不易提取，而且ATP的成本高昂，这成为一大限制因素。近年来，以酵母为主的发酵法应用广泛，但是以大肠杆菌为表达系统的发酵法还是比较缺乏，本论文探索性尝试以重组大肠杆菌为菌种进行发酵，并且优化了发酵参数。 本课题首先以大肠杆菌BL21为表达系统，构建两种重组菌BL21-pET-28a-metK和BL21-pET-32a-metK，达到克隆S-腺苷蛋氨酸合成酶基因(metK)的效果，并从分子和蛋白质的角度分别证明已成功构建了重组载体pET-28a-metK和pET-32a-metK。 再利用HPLC对两种重组菌的SAM产量作了对比，得到高产菌株，命名为ZJGS-SAM，并选出发酵培养基成分和发酵条件中的六种因素，通过P-B实验从这六种因素中又得到了三个主要因素:酵母膏、装液量和pH，利用最陡爬坡实验得到了三个中心点的浓度，接着通过Box-Behnken Design实验得到一组可以使产量达到相对较高的一组培养基成分:乳糖20g/L，大豆蛋白胨40 g/L，酵母膏35g/L，NaCl10g/L，MgSO41.2 g/L，L-蛋氨酸1g/L;培养条件为初始培养基pH7.5，诱导温度33℃，接种量1％，转速220 rpm，装液量30 mL(250 mL摇瓶)。在优化条件的基础上发酵12h，对比未优化的35 mg/L原是产量，提高了271.4％。 通过上罐发酵进行验证，在分批发酵方式下，优化了pH条件和通气量的选择，产量达到87.88 mg/L，接着在分批补料发酵的方式下，采用了以乳糖为碳源的恒速流加的补料方式，提高了最终产量，达到了300.9 mg/L的浓度，并得到一组适合5L发酵罐生产的数据，从而为大量制备SAM奠定重要基础。
S-腺苷蛋氨酸;重组大肠杆菌;合成工艺;生物活性
浙江工商大学
硕士
生物化工
于平
2015
中文
TQ464.7;TQ460.6
80
2016-06-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）