里氏木霉纤维素酶基因转录调控因子Xyr1功能研究及铜离子响应高效表达体系的建立
纤维素是目前地球上含量最为丰富的碳水化合物之一，是植物以及藻类细胞壁的重要组成部分，每年通过光合作用大约产生1.5-1.7×1011吨的纤维素，纤维素的合成及降解构成了地球碳循环的重要组成部分。另一方面，随着人们对化石燃料的不断开采，煤炭、石油等资源濒临枯竭，充分利用自然界中大量存在的可再生生物质进行生物燃料转化成为目前研究的一个热点。丝状真菌是目前工业纤维素酶生产的主要菌株，其中里氏木霉（Trichoderma reesei）是其中典型代表，其能够向胞外分泌大量的纤维素外切酶、内切酶以及葡萄糖苷酶三种类型的纤维素酶，酶量可占胞外蛋白总分泌量的60％以上。里氏木霉一个重要的生理学特性就是只有当胞外存在纤维素、乳糖及槐糖等诱导物时，纤维素酶才被大量诱导表达;而在葡萄糖培养条件下，其表达完全被抑制。里氏木霉这一高效诱导产酶特性一直被大家广泛关注，但其中的具体调控机制尚未被完全解释清楚。 在一系列参与纤维素酶基因转录调控的转录因子中，Xyr1是纤维素酶基因诱导表达的关键转录激活因子。当Xyr1缺失时，除了bgl2外基本所有的纤维素酶及半纤维素酶基因均不发生转录，但其具体的转录激活机制尚不清楚。因此，对Xyr1功能的深入研究将为深入阐述里氏木霉纤维素酶基因的表达调控机制，全面阐述纤维素酶基因转录调控网络奠定理论基础;同时也将为理性遗传改造工业生产菌株，提高纤维素酶的表达水平提供相应的理论指导。 论文围绕分析Xyr1的功能展开，主要研究内容与研究结果如下: 1.里氏木霉纤维素酶基因转录因子Xyr1的相关结构域结构功能分析。 生物信息学分析发现，里氏木霉纤维素酶基因转录调控因子Xyr1与酵母半乳糖苷酶转录调控因子Gal4结构类似，属于真菌特异的锌指双核结构转录因子。进化树分析发现Xyr1及其同源物在黑曲霉，构巢曲霉，粗糙脉孢霉等丝状真菌中普遍存在。根据Gal4的结构域特征，我们将Xyr1分为DNA结合结构域(DBD)，中间同源(Middle Homology Region，MHR)及转录激活区(Activatingdomain，AD)三个结构域。凝胶泳动迁移技术(Electrophoresis Mobility Shift Assay，EMSA)以及酵母单杂交分析，Xyr1 DBD区域与cbh1启动子多个区域均能进行相互作用，其中对cbh1启动子的-800及-200区域有较强的结合能力。对XYR1潜在的磷酸化修饰位点突变之后，其DNA结合能力有所下降，且体内转录激活能力出现下降。此外，等电点分析发现，Xyr1 AD区域与Gal4 AD区域存在明显的不同，Xyr1 AD区域并不以绝对的酸性区域存在，而是以酸性区-疏水区-碱性区这种类型的形式呈现，而目前转录激活域的酸性性质被认为是特定转录激活因子发挥转录激活功能的结构基础。酵母双杂交结果进一步表明，Xyr1 AD区域与Xyr1 MHR区域存在可能的相互作用。 进一步通过在△xyr1菌株中构建一系列Xyr1突变体，并对其活性功能进行体内分析研究，从而确定Xyr1不同结构域在纤维素酶基因激活表达中的作用。实验结果表明， Xyr1 DBD的单独表达并不能不能与cbh1启动子进行有效的结合。单独表达缺失了Xyr1 DBD的MHR-AD区域突变体时其在葡萄糖上定位于细胞质中，在葡萄糖耗尽及纤维素诱导条件下均定位于液泡中，而在MHR缺失突变体中没有相应的表达荧光信号，因此推断Xyr1 MHR区域对于维持蛋白结构稳定性具有非常关键的作用。当单独表达缺失了AD的Xyr1时，其表达水平虽较低，但仍能够微弱的激活纤维酶基因的转录，而当将AD最后的碱性区片段缺失突变之后，突变体不再表达纤维酶，且不能激活转录。当AD区域置换为全部酸性的Gal4AD之后，转录激活能力很低。因此Xyr1的AD可能在维持蛋白整体稳定性方面比介导激活纤维素酶基因转录更为重要。 2.基于铜离子透性酶基因启动子Ptcu1的表达体系构建 为了进一步明确Xyr1表达水平对纤维素酶基因表达的激活效应，分别利用gpd启动子及自身启动子在△xyr1菌株中表达gfp-xyr1。结果发现在葡萄糖培养条件下，P gpd-gfp-xyr1菌株有比较明显的荧光信号，且在培养后期发酵液中检测到CBH1的分泌;将其进一步在乳糖及Avicel表达时，没有非常明显的荧光信号，发现在纤维素为碳源进行培养时CBH1的分泌量要低于QM9414野生型菌株，同时菌株没有明显的荧光信号。表明gpd启动子强烈地受到环境中碳源的影响，为寻找一个不依赖于碳源且能够介导目标基因高水平表达的启动子，我们通过序列比对在里氏木霉基因组中鉴定到铜离子透性酶基因tcu1(Tr52315)。利用实时定量PCR对其转录分析发现，tcu1无论在葡萄糖、甘油及纤维素为碳源的培养条件下均能够高水平表达。这种表达受铜离子抑制，tcu1的转录水平随铜离子浓度的增加而降低，且外源铜离子的添加可迅速关闭tcu1的转录的，而铜离子螯合剂BCS可部分恢复被铜离子抑制的tcu1转录。为了进一步研究此启动子对其它基因的调控能力，利用Ptcu1表达gfp报告基因，通过荧光观察铜离子能够调控GFP的表达;Ptcu1同样可以驱动cbh1及eg1的高水平表达且对外源铜离子特异响应。另一方面，利用Ptcu1对内源性启动子置换试验，发现可以利用铜离子启动子实现对目标基因的可控性表达及抑制，从而为通过条件性缺失或转录下调来研究某些必需基因功能奠定了基础。 3.高水平Xyr1介导纤维素酶的组成型表达及Cre1对纤维素酶调控模式初探 细胞定位分析发现，Xyr1在诱导与非诱导条件下均定位于细胞核中。在△xyr1菌株基础上构建获得了利用铜离子透性酶基因启动子Ptcu1介导Xyr1过表达的重组菌株P tcu1-xyr1。结果表明，Ptcu1-xyr1菌株在葡萄糖或甘油非诱导碳源上不仅解除了碳代谢阻遏，而且胞外纤维素酶活与亲本菌QM9414在纤维素诱导下的酶活相当。P tcu1-xyr1这种在非诱导条件下全面表达纤维素酶的能力与Xyr1的表达水平呈正相关。虽然Ptcu1-xyr1菌株在Avicel诱导下酶活没有进一步提升，但其在乳糖诱导下酶活出现了大幅度的提升。结果表明xyr1过表达会导致菌株对压力响应更为敏感。染色质免疫共沉淀结果表明，xyr1过表达菌株无论在诱导与非诱导条件下，Xyr1与cbh1启动子的结合效率要比QM9414在Avicel在诱导条件下高20-30倍。通过染色质可及性分析，Xyr1过表达菌株中cbh1启动子的染色质结构相对于QM9414更为开放。由此可以推测Xyr1对纤维素酶基因启动子的高效结合，从而导致染色质结构更为开放是Xyr1过表达菌株纤维素酶高水平表达的一个主要因素。 在纤维素酶基因的转录调控中，Cre1是主要的转录抑制因子，在碳代谢阻遏中发挥着重要的作用。通过分析Cre1对于Xyr1调控方式研究，发现Cre1能够在体内及体外均可以结合xyr1基因启动子。ChIP分析Cre1在体内与cbh1启动子并没有明显的结合。在Ptcu1-gfp-xyr1菌株中利用Ptcu1启动子置换cre1启动子，分析重组菌株的诱导特异特征时发现，与单独过表达Cre1菌株不同，在Xyr1过表达的条件下，Cre1的过表达对纤维素酶表达并未产生影响。推测Cre1可能是通过调控xyr1的转录间接来调控纤维素酶基因表达。 4.与Xyr1相关的其他纤维素酶基因转录调控因子的分析研究 Xyr1在纤维素酶基因转录激活过程中，同样会有其它相关因子与之相互作用，共同调控纤维素酶基因的表达。为了寻找这些相关蛋白，利用酵母双杂交文库筛选我们得到与Xyr1 AD相互作用蛋白Tr30478的羧基端部分，检测分析其同样也可以与Xyr1 MHR进行相互作用，通过敲除与过表达分析Tr30478对纤维素酶基因的表达发挥抑制作用，通过荧光定位分析其定位于细胞质中。利用酵母双杂交发现，Tr30478 C-端部分也与Xyr1 MHR区域具有相互作用，我们推测其可能在细胞质通过调控Xyr1 MHR与AD的相互作用发挥功能。 在纤维素酶基因诱导表达过程中，Xyr1同样发生转录上调。为了研究哪些转录因子参与Xyr1自身的转录调控。利用酵母单杂交文库筛选我们利用xyr1启动子筛选得到了三个与其相互作用的蛋白，包括两个转录因子及一个磷酸激酶Sch9，这三个蛋白可能会通过调控xyr1的转录来调控纤维素酶基因的转录。
里氏木霉纤维素;酶基因转录调控因子;功能分析;铜离子;响应机制;基因表达体系
山东大学
博士
微生物学
刘巍峰;陈冠军
2015
中文
Q539.3
171
2016-06-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）