DAM的发酵放大及其诱导HeLa细胞凋亡机制的初步研究
丰富的海洋生物资源为天然产物提供了重要来源，红树内生真菌由于独特的生理和代谢系统，产生了一些新颖独特的次级代谢产物。去乙酰真菌环氧二烯（Deacetylmycoepoxydiene，DAM）是本课题组杨丽珊同学从红树植物秋茄内生拟茎点霉属真菌A-1-2-3次级代谢产物中分离得到，具有新颖的含氧桥结构骨架，前期实验表明，该化合物具有较强的抗肿瘤活性。 本论文通过对菌株发酵技术参数的优化，确立了DAM液体发酵放大的工艺控制流程并进行了规模制备，初步阐明了DAM的抗肿瘤作用及其诱导HeLa细胞凋亡的作用机制，并通过裸鼠移植瘤模型验证其体内抗肿瘤作用。主要研究结果包括以下几个方面: 1)在10L罐水平筛选确定P2-139菌株作为后续发酵菌株，并对P2-139发酵培养基质中的葡萄糖浓度和马铃薯汁浓度、接种量及发酵转速进行调整优化，最终确定P2-139的发酵培养基组成:马铃薯200g/L、葡萄糖65g/L、陈海水20％（V/V）;接种量为5-7％之间;10L罐转速控制在400r/min以内，200L罐300r/mim以内。 2)10L罐水平上，以发酵不同阶段的临界氧浓度和KLa为依据，并考虑生物量的影响，我们提出了通过对转速和通气量的调节，使DO在发酵前期维持在20％～30％，发酵中期在28％以上，发酵后期在30％～60％的分阶段溶氧控制发酵工艺，并取得了良好的效果，DAM产量稳定可达100mg/L以上。 3)通过对发酵过程残糖浓度的测定，结合DAM产生特点，提出发酵后期流加补料策略，对比了不同的补料形式与浓度，最终确定葡萄糖+马铃薯汁复合补料流加的方式，并将残糖浓度控制在10g/L的方案。 4)利用上述优化后的发酵条件，以DO控制为准则在200L罐上进行中试放大，DAM产量达到123.1mg/L，发酵数次，并规模制备，共制备20g以上的DAM。 5)通过MTT实验发现，DAM可有效抑制多种肿瘤细胞的生长增殖，其中HeLa细胞对DAM作用最敏感。 6) DAM可诱导HeLa细胞出现caspase依赖性的凋亡，凋亡过程出现Bax向线粒体聚集，Cyto C从线粒体释放，抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL表达量下降，而促凋亡蛋白Bax等上调。DAM可诱导HeLa细胞出现G2/M期周期阻滞，多个与周期相关蛋白含量出现变化，p21、CyclinB1、GADD45α上调，Cdc25c、Wee1等下降。 7) DAM诱导的HeLa细胞凋亡与ROS含量的上升相关， DAM可引起Trx-ASK1复合物的分离，并进而激活相关信号通路。DAM可抑制HeLa细胞内与细胞存活相关的多个Hsp90客户蛋白的表达，并可持续性激活MEK/ERK信号通路。 8)通过HeLa细胞裸鼠移植瘤实验发现，DAM能有效抑制移植瘤的生长，抑制率达64.8％，通过对移植瘤的免疫组化分析，发现DAM可引起移植瘤内多种Hsp90相关蛋白改变，AKT蛋白表达量在给药组明显下降，MEK和ERK的磷酸化水平明显上升。 以上研究结果为具有自主知识产权的DAM的工业化规模发酵制备，并将其作为抗肿瘤药物的开发研究奠定了基础。
去乙酰真菌环氧乙酯;发酵放大技术;HeLa细胞;Hsp90客户蛋白;抗肿瘤活性
厦门大学
博士
微生物学
苏文金;张连茹;黄耀坚
2015
中文
TQ460.6
144
2016-06-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）