急性缺血脑组织靶向肽的筛选、鉴定及分子成像研究
急性缺血性脑卒中能够引发大脑神经组织的一系列应激反应，包括酸中毒、兴奋性氨基酸释放、细胞内钙超载、氧自由基释放、炎症反应及细胞凋亡，这些应激反应的进展通常反应脑卒中的病理进程。准确评价脑缺血后某一时期应激反应进展，实现其定位、定性、定量及可视化，对于评估脑损伤与修复、指导脑卒中的个体化治疗和预测病人预后具有重要的意义。分子影像技术能够通过特异性的分子探针从活细胞水平实现特定分子的可视化和定量研究，可用于脑缺血后病理进程的监测。但现有的可用于脑卒中分子成像的特异性分子探针报道并不多见，限制了分子影像技术的应用。本研究通过噬菌体展示肽库体内筛选技术，以期获得能够靶向缺血脑组织的多肽，并构建分子探针，初步实现缺血脑卒中的分子成像，主要实验结果如下: 1、急性缺血脑组织靶向分子的体内筛选 通过线栓法构建小鼠右侧大脑中动脉阻塞(MCAO)模型，模拟人类急性缺血性脑卒中。通过噬菌体展示七肽库对MCAO小鼠进行体内筛选，经四轮筛选后噬菌体克隆在MCAO小鼠缺血侧脑组织的密度较第一轮筛选时富集了10.4倍。从第四轮筛选所回收噬菌体克隆中随机挑选120个分隔良好的蓝色噬菌斑进行扩增培养后，提取DNA测序，最终成功测序106个噬菌体克隆，共得到17种序列，其中多肽序列HGGVRLY出现频次最高，占有绝对优势，将其命名为HGG肽，展示有该肽的噬菌体克隆命名为HGG-M13噬菌体，作为候选噬菌体用于后续实验。 2、HGG-M13噬菌体肽及HGG肽靶向缺血脑组织的特异性鉴定 本研究首先从HGG-M13噬菌体的角度，通过噬菌体体内回输实验和免疫荧光实验鉴定HGG-M13噬菌体能够靶向缺血脑组织，而且这种靶向性依赖于噬菌体表面展示的HGG肽而不是噬菌体自身的骨架蛋白;免疫荧光双标实验结果提示HGG-M13噬菌体与缺血脑组织中部分神经元共定位。 随后，分别采用5-TAMRA和FITC两种荧光基团修饰HGG肽，并注射至MCAO小鼠体内，HGG荧光肽主要集中在缺血侧脑组织，与HGG-M13噬菌体结果相一致，再次提示HGG肽能够靶向缺血脑组织。此外，通过体外培养神经元，构建氧糖剥夺模型，并用HGG荧光肽与之孵育，结果提示HGG荧光肽能够与氧糖剥夺后的神经元结合。 3、基于HGG肽构建急性脑缺血靶向分子探针及初步分子成像 在EDC/Sulfa-NHS活化下，HGG肽上的氨基与锰锌铁氧体纳米颗粒表面所携带的羧基发生缩合反应，使得锰锌铁氧体纳米颗粒表面修饰HGG肽，从而构建得到分子探针，并对其表征:电镜尺寸大小为15.17 nm，水合粒径为53.98 nm，r2弛豫率为382.45mM-1S-1。将该分子探针注射至MCAO小鼠体内，通过磁共振成像检测到该分子探针的信号主要聚集在大脑缺血侧，而未经HGG肽修饰的锰锌铁氧体对照探针则无信号。 综上所述，本研究通过噬菌体展示肽库筛选技术对MCAO小鼠进行体内筛选，得到能够靶向缺血脑组织的HGG肽，并初步鉴定了该肽的靶细胞为缺血状态下的神经元。基于该肽构建了磁共振成像分子探针，磁共振成像显示该分子探针能够在MCAO小鼠的缺血侧脑组织内分布，但是否可用于脑卒中的分子成像需要进一步深入研究。
缺血性脑卒中;HGG肽;体内筛选技术;特异性鉴定;分子成像
东南大学
硕士
遗传学
张建琼
2015
中文
R743.3;R741.02
77
2016-05-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）