使用原基分布图技术研究观察异氟烷对新生小鼠的神经毒性
大量研究证实，麻醉药物于发育期的动物具有神经毒性作用。但在其导致神经毒性的过程中，哪些细胞死亡或者得以幸存，目前尚不明确。本实验使用基因标记的原基分布图（fate-map）来标记发育中或是成年小鼠的大脑内的新生细胞，以此来识别对麻醉药物致神经毒性敏感的细胞种类。 本实验选用Gli-CreERT2种系的小鼠，Gli是启动子，用他莫昔芬可以诱导Cre重组酶的表达。Gli种系小鼠与绿色荧光蛋白(GFP)报告基因小鼠杂交获得的双转基因下代被用于本实验。Gli-CreERT2∷GFP双转基因小鼠出生后7天，给予皮下注射250mg/kg他莫昔芬激活Cre重组酶，切除GFP基因两端的终止密码子，海马区域内表达Gli的颗粒细胞祖细胞及其后代细胞自此将持续表达绿色荧光蛋白，借此可观察GFP表达细胞来评估神经元的生存情况和形态学改变。为观察异氟烷对新生小鼠发育中的大脑的影响，本实验分为两个部分: (1)异氟烷对小鼠发育中大脑的短期影响 本部分实验的目的是观察新生小鼠在接受异氟烷麻醉后神经细胞凋亡的情况。皮下注射他莫西芬两周后，即小鼠出生后21天(P21)，小鼠被随机分为对照组（吸入空气6小时）或麻醉组（吸入1.5％异氟烷6小时）。立即给予腹腔注射氯胺酮+乙酰丙嗪+甲苯噻嗪混合溶液，经心脏灌注肝素化PBS溶液，再灌注甲醛溶液、取脑，并在甲醛溶液内固定、冷冻。冰冻切片成60μm的组织薄片，用GFP和Caspase-3（用来标记细胞凋亡）免疫荧光染色。利用共聚焦显微镜分别对齿状回上支中部和下支中部分层扫描。用Neurolucida软件导入分层图像，对表达GFP和/或Caspase-3的细胞进行计数。同时观察同时表达GFP+caspase-3细胞的形态。由不知分组情况的观察者进行细胞计数和细胞形态评估。 与对照组相比，麻醉组GFP细胞的数量和分布位置差异无统计学意义，caspase-3表达细胞密度显著增加（上支:对照组:22071±6547/mm3，麻醉组:119220±14566/mm3，P＜0.001;下支:麻醉组:对照组:47283±7870/mm3，209634±15732/mm3，P＜0.001）;GFP细胞中同时表达Caspase-3的细胞比例增加(上支:对照组0.9％，麻醉组22.9％，P＜0.001;下支:对照组2.7％，麻醉组27.7％，P＜0.001P＜0.001)，且形态发生退变变性，主要表现为树突抽回和卷边。 (2)异氟烷对于新生小鼠大脑的长期影响 本部分实验的目的是观察新生小鼠在接受异氟烷麻醉后神经细胞凋亡是否长期存在。皮下注射他莫西芬两周后，小鼠P21天时，小鼠被随机分为对照组（吸入空气6小时）或麻醉组（吸入1.5％异氟烷6小时），结束后待麻醉组小鼠清醒后，与对照组小鼠一起，放回其各自母鼠笼内，P28天予以断奶、分笼。小鼠P81天，给予腹腔注射氯胺酮+乙酰丙嗪+甲苯噻嗪混合溶液，经心脏灌注肝素化的PBS溶液，再灌注甲醛溶液、取脑，并在甲醛溶液内固定、冷冻。冰冻切片成60μm的组织薄片，用GFP和Caspase-3、或GFP、Calretinin和Ki-67染色。利用共聚焦显微镜对齿状回嵴部上支中部和下支中部逐层分层扫描。用Neurolucida软件导入分层图像，分别对表达GFP、Caspase-3、Calretinin（标记未成熟的颗粒细胞）、Ki-67（标记细胞增殖状态）的细胞，同时表达GFP+Calretinin或GFP+Ki-67的细胞，在齿状回门区和分子层的异位GFP标记细胞进行计数。由不知分组情况的观察者来进行细胞计数。 本实验的第一部分，麻醉导致22.9-27.7％的GFP标记细胞凋亡，若这些凋亡的GFP细胞在60天内未恢复，则本部分实验中也应观察到与对照组相比，麻醉组的GFP标记细胞数量大约要少22.9-27.7％。而实际上，对照组和麻醉组的GFP标记细胞的数量和分布位置差异无统计学意义。提示在麻醉后60天内，神经细胞可能通过存活的神经祖细胞增加细胞增殖得到恢复。同时，与对照组一样，麻醉组几乎未见到Caspase-3表达细胞，提示异氟烷麻醉后颗粒细胞不会持续大量凋亡。与对照组相比，麻醉组GFP标记细胞中表达Calretinin的细胞比例和表达Ki-67的细胞比例的差异无统计学意义，提示在麻醉后60天内，恢复过程已经完成。在齿状回门区和颗粒细胞分子层的异位GFP表达细胞在两组间的差异也无统计学意义，提示麻醉后的神经元细胞遵循正常模式迁移。 本实验使用细胞标记技术来标记齿状回颗粒细胞，提示两周左右的神经元细胞对于异氟烷的神经毒性非常敏感。同时表明异氟烷对神经系统的损伤可随时间恢复。这种原基分布图技术可以用来观察麻醉对于神经细胞结构和整合情况的短期和长期影响。
麻醉药物;异氟烷;神经毒性;原基分布图技术
温州医科大学
博士
麻醉学
连庆泉
2015
中文
R971.2
69
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）