L-天冬酰胺酶基因工程菌的构建
L-天冬酰胺酶(L-asparaginase)又名L-门冬酰胺酶，左旋门冬酰胺酶，目前适用于治疗黑色素瘤、急性淋巴细胞性白血病(ALL)等，也可以用于治疗单核细胞类别的急性白血病、淋巴细胞类别的慢性白血病、非何杰金病淋巴瘤等。L-天冬酰胺酶使血液中的天冬酰胺分解成氨和天冬氨酸，天冬酰胺在血液中的浓度降低，使肿瘤细胞因为必要的天冬酰胺不能满足正常生长的需要，达到抑制肿瘤的目的。同时，大量的天冬酰胺合成酶存在于正常细胞内，正常细胞生长不受影响。因此，L-天冬酰胺酶得到医药界的普遍认可，许多年来临床化疗一直使用其作为药物辅助治疗ALL和非霍奇金淋巴瘤。来源于微生物的L-天冬酰胺酶比较常见，包括细菌、真菌、古生菌等，目前假单胞杆菌、枝孢霉菌、大肠杆菌、假丝酵母菌、欧文氏菌、地衣芽孢杆菌等来源的L-天冬酰胺酶已经被证实具有抗肿瘤活性。其中大肠杆菌来源的L-天冬酰胺酶能提供更加稳定的抗癌效果，其具有更低的生产本钱，产品的优势也更强大。近些年来，随着基因工程技术的高速稳定发展，利用其构建L-天冬酰胺酶基因工程菌的报道日益增多，基因工程菌L-天冬酰胺酶已经逐渐地成为了一个重要来源。迅速实现构建重组L-天冬酰胺酶工程菌，并使其大量表达L-天冬酰胺酶，优化其提取纯化工艺，逐步应用于标准工业化生产，可以国内企业用更少的本钱生产L-天冬酰胺酶，也在国内非霍奇金淋巴瘤和ALL的临床化疗方面有非常积极的意义。 在这项研究中，我们把大肠杆菌AS1.357总DNA作为模板，设计特异性引物，完成L-门冬酰胺酶基因ansB的PCR扩增，将获得的基因工程菌经IPTG诱导表达AnsB蛋白，并利用重组标签His-tag，通过Ni-NTA亲和层析对重组AnsB蛋白进行纯化，再利用Pall超滤管进行除盐浓缩，利用SDS-PAGE凝胶电泳对重组AnsB蛋白进行定性分析，使用考马斯亮蓝法测定重组AnsB蛋白含量，最后得到由ansB基因表达的纯度很高、浓度达到62.7 mg/L的重组蛋白，纯化的重组蛋白产量达到42.28％，酶活性为137 IU/mL。比原始菌株大肠杆菌AS1.357提高了接近20倍，并且排除了大肠杆菌本底表达L-天冬酰胺酶的背景。这为后续完成L-天冬酰胺酶的药理和毒理实验，以及优化其发酵工艺和提取工艺，并逐步应用到工业化生产奠定了基础，为开发具有最优异成效的L-天冬酰胺酶的抗肿瘤药物提供了很大可能。
基因工程菌;L-天冬酰胺酶;提取纯化工艺;酶活性
济南大学
硕士
生物工程
谷劲松
2015
中文
Q781
60
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）