毛细管区带电泳法快速分离珠蛋白肽链及其应用研究
目的： 血红蛋白病是一类由珠蛋白结构异常或者合成不足引起的遗传性疾病，主要分为地中海贫血（简称“地贫”）和异常血红蛋白。地贫主要是因为珠蛋白基因异常，使珠蛋白肽链合成受到抑制而导致类α肽链和类β肽链失衡的一组遗传性溶血性疾病。根据α-和β-链失衡程度可分为以下三类:（一）地贫基因携带者，此类个体常无明显的临床症状。α-地贫基因携带者基因型多为-α/αα，ααT/αα，αTα/αα，-α/-α，-α/α Tα;β-地贫基因携带者常见基因型为β+/βN，β0/βN。（二）中间型地贫:该型临床表型严重程度不同，贫血程度也有很大差别。中间型α-地贫又称Hb H病，此类患者基因型多为--/-α或--/α Tα。而中间型β-地贫患者的基因型多为β+/β+，β+/β0，β-地贫复合HPFH，δβ-地贫。（三）重型地贫:该型包括重型α-地贫和重型β-地贫。由于重型α-地贫四个α-珠蛋白基因缺如，γ-珠蛋白相对过剩，聚集产生Hb Bart's(γ4)γ又称Hb Bart's胎儿水肿综合征，其基因型为--/--。重型β-地贫的基因型为β0/β+，β0/β0。异常血红蛋白则是因为珠蛋白链的分子结构发生改变，导致相应蛋白结构、功能、合成和/或稳定性产生改变的一组遗传性疾病。 表型研究在异常血红蛋白疾病的诊断以及病情预判中占有重要的地位。现阶段用于地中海贫血和异常血红蛋白辅助诊断的临床表型研究指标有平均红细胞体积(MCV)，平均红细胞血红蛋白含量(MCH)，异常的HbA2、 HbF含量以及异常血红蛋白的检出。尽管如此，由于表型与基因关系的复杂性加大了研究的困难，因此联合各种表型检查技术辅助诊断地贫是很有必要的。为了更好的理解地贫，揭示α/非α链不平衡的程度，确定未知异常血红蛋白和监测动物实验以及相关珠蛋白基因疗法的血液学研究，珠蛋白链的成份分析和结构鉴定研究就尤为重要。迄今为止，已报道有多种方法用于珠蛋白肽链分析，包括酶联免疫法测定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)，凝胶电泳，高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）和反相高效液相色谱法（Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography，RP-HPLC）。但是这些方法仍然面临操作繁琐，样品制备耗时和分辨率有限等缺点。最近，毛细管电泳(Capillary Electrophoresis，CE)技术因其高效率，低样品消耗，分析时间短，溶剂消耗少和分离能力高等优势正在成为人类珠蛋白链分离有吸引力的工具之一。在毛细管应用研究中一些研究人员主要集中于探讨涂层毛细管在珠蛋白链的分离和定量中的应用。然而，商业性涂层毛细管因其昂贵的费用，使用的有限性以及复杂费时的处理过程限制了它在临床实验室的应用。有研究发现在酸性条件下使用未涂层毛细管，以动态涂层替代永久性涂层同样可以获得良好的分离效果。尽管目前出现了基于该法的分析条件，却并没有得到广泛的应用。在实际应用中，我们仍面临许多问题，例如:如何简化复杂的处理过程;如何提高实验效率获得高的分辨率等。毛细管分离性能的提高和条件的优化可能是两个主要的思考方向。另外一个需要面临的问题是，目前所报道的相关文献中的方法条件均有所不同，找到其中的共同规律对于有此类需求的工作而言显然具有重要意义。 本研究的主要目的是基于毛细管区带电泳技术建立一种快速珠蛋白肽链分离方法，并探讨该法在提示异常血红蛋白病的临床应用价值，同时为相关工作提供有益的经验。 方法： 1.样本收集:在本研究中，选取20例样本（每种类型地贫各4例）用于前期分离方法的建立和实验条件优化。另选4个样品（正常的成人，正常新生儿，Hb H病，中重型β-地贫）分别平行测定5次用来评估该实验的重复性。另外，共收集了310例临床样本，其中正常样本58例，α-静止型和标准型共107例，Hb H病39例，β-地贫携带者43例，中重型β-地贫63例。样本首先进行血液学表型分析初筛:血常规（重要指标:MCV、MCH），血红蛋白筛查（异常血红蛋白HbE、Hb H等的检出，HbA2）;在血液学指导下进行分子诊断，常见α-地贫缺失突变选用多重Gap-PCR技术进行检测、常见α-地贫和β-地贫点突变选用反向点杂交(Reverse Dot Blot，RDB)技术进行检测。 2.毛细管区带电泳（Capillary Zone Electrophoresis，CZE）方法的建立:总结相关参考文献，采用国产未涂层石英毛细管(70 cm×50μm)，电泳缓冲液为100 mM磷酸二氢钠水溶液，工作温度25℃，检测波长214nm。首先用正常成人、正常新生儿、Hb H病以及中重型β-地中海贫患者血液样本作方法建立、初步进行珠蛋白肽链分离以及条件优化。采用以下方式预处理进样样品:25μl抗凝血经0.9％生理盐水洗涤3次后，溶于1ml去离子超纯水，低速离心后取上清。参考相关文献，选择pH＜3进行筛选并优化电泳条件;观察不同分离电压、pH、温度以及波长对电泳分离行为的影响并进行重复性评价。 3.应用研究:对58例正常成人样本，107例α-地贫静止型/标准型，39例Hb H病，43例β-地贫携带者，63例β-地贫中重型通过该方法检测后进行统计分析。基于正常组与各病例组统计比较结果(SPSS13.0)，用受试者工作特征曲线(ROC)分析α/β对于β-地贫携带者、Hb H病的筛查效率，经比较优选最佳截断值;通过使用双变量相关分析计算斯皮尔曼相关系数来确定β-地贫中重型样品中γ/α面积比和HbF的水平之间的关联程度。另外用所建立方法分析常见异常血红蛋白。 结果： 经筛选得到最优电泳条件如下:25μl的全血用生理盐水洗涤3次除去血浆。洗涤后的红细胞用1ml去离子水作溶血处理。溶血产物4000 r/min离心10分钟，去除细胞碎片后压力进样（3秒）。采用国产未涂层石英毛细管70 cm（总长）×50um（内径），分离电压19 KV，UV检测，设置检测波长214 nm;电泳缓冲液采用磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L磷酸二氢纳，三氟乙酸调节pH至2.14），0.25％PEG-6000作动态涂层。在此电泳条件下，pre-β，β，α，γ在17min内被很好分离。同一样品连续五次进样，各成分保留时间变异系数(CV)为0.37-1.69％，峰面积CV为0.46-6.71％，证实此法的稳定性较好。降低pH可使电泳出峰峰图更尖锐，分辨率增高，然而对珠蛋白肽链保留时间的影响则并不显著。低pH环境(＜3)主要可减少石英管壁对蛋白质的吸附。同时极端pH环境以及高浓度磷酸缓冲液直接使血红蛋白四聚体解聚离解链成α-和β-珠蛋白链并保持单链状态。在仪器有效范围内，增大分离电压可有效提升分离速度，使峰型更加尖锐，分辨率增高，但是相应的两成分之间的有效分离距离将会缩小，产生部分重叠。温度亦是可影响分离行为的重要因素之一，实验表明升高温度可以减少肽链迁移时间，然而在高温环境下异常峰的出现会干扰肽链的分析，且分离基线随着温度升高变得不稳定。以上结果提示在仪器有效范围内可通过增大分离电压或升高温度来提高分析效率，但增大分离电压可使分辨率下降，升高分离温度可使分离基线不稳定，因此，在实际工作中需根据实验目的对相关参数进行调整。 统计比较结果提示，α/β在正常与其他各组之间均有统计学差异(P＜0.05)。但正常组与α-地贫静止型/标准型组、β-地贫携带者组均值差异不大，可能是因为正常珠蛋白链表达补偿性增高或多余的肽链的降解而导致。基于前项分析结果，我们采用ROC曲线分析α/β比值对于提示Hb H病、中重型β-地贫诊断有重要意义，前者敏感性为100％，特异性为97.4％，后者特异性敏感性均达100％。通过对52例β-地贫中重型病人HbF值与γ/α面积比值做分析，显示两者之间有较高相关性（R2=0.8318，P＜0.01），进一步提示了毛细管区带电泳对珠蛋白肽链分析方法的可行性。另外，7例Hb WS和2例Hb G-Honolulu均被准确筛查出，但同样常见于中国人群的Hb CS和Hb QS用本法却未能检测出，可能是因为Hb CS和Hb QS不稳定容易降解所致或是本法的敏感性不足以检测出这两种异常血红蛋白。 结论： α-，β-和γ-链的分离以及异常血红蛋白的检出表明本方法适合于地贫和异常血红蛋白的临床诊断，地贫治疗评价以及其他相关研究。同时α/β面积比的ROC分析对提示中重型β-地贫、Hb H病有较高的敏感性和特异性。此外，本研究所建立方法研究策略以及各相关参数优化的工作经验总结对类似工作具有一定的参考价值。
血红蛋白病;临床诊断;毛细管区带电泳技术;珠蛋白肽链
南方医科大学
硕士
遗传学
徐湘民
2015
中文
R556.704
82
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）