肝窦内皮旁分泌MIF促进肝内预转移结直肠癌细胞的趋化和生长
目的： 本课题通过比较结直肠癌肿瘤细胞与转移靶器官（肝）及非靶器官内实质和间质细胞之间相互的趋化作用，筛选和鉴定与肿瘤细胞作用密切的关键细胞和细胞因子，阐明其调节肿瘤细胞生长和转移行为的分子机制，针对肿瘤细胞和靶器官微环境协同作用的细胞因子进行治疗，以获得抗种子和抗土壤的双重抗肿瘤转移治疗。 方法： 1.筛选结直肠癌转移靶器官（肝）与肿瘤细胞之间起趋化作用的关键细胞。 我们首先评估了结直肠癌转移靶器官（肝）来源的与非靶器官来源的正常细胞对结直肠癌细胞的趋化作用。应用Transwell迁移小室实验来比较正常细胞对结直肠癌(CRC)细胞的趋化作用，将人正常的细胞分别置入迁移小室的下层，结直肠癌细胞(SW480、HCT116和LS174T)分别铺在迁移小室的上层。人肝内的正常细胞包括HHSECs（人肝窦内皮细胞）、HL7702（人肝细胞）和LX-2（人肝星状细胞），非靶器官来源的正常细胞包括HUVECs（人脐静脉内皮细胞）、293A（人胚肾细胞）和BJ（人包皮成纤维细胞）。随后将正常细胞和肿瘤细胞的位置互换，HHSECs、 HUVECs、 HL7702和LX-2细胞置于小室的上层，结直肠癌细胞置于小室的下层，观察肿瘤细胞是否具有趋化正常细胞迁移的能力。 2.筛选转移靶器官肝窦内皮细胞(HHSECs)趋化肿瘤细胞迁移的关键细胞因子。 收集Transwell小室上室和下室的细胞培养上清液，利用含有1000种人细胞因子抗体芯片筛选出HHSECs趋化肿瘤细胞迁移的关键细胞因子-白细胞游走抑制因子(MIF)。用含有MIF干扰片段的shRNA构建的慢病毒载体包被的病毒颗粒分别转染HHSECs和结直肠癌细胞，以建立稳定干扰MIF表达的细胞株。利用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-Time PCR)技术、免疫蛋白印迹实验(Western Blot)和酶链免疫吸附实验(ELISA)在细胞mRNA和蛋白表达以及外分泌水平检测干扰效率。最后再通过Transwell小室，利用Mock/HHSECs条件培养基，shMIF/HHSECs条件培养基，Mock/HHSECs条件培养基加入p425（MIF特异性抑制剂）以及shMIF/HHSECs条件培养基中加入rhMIF（重组人白细胞游走抑制因子）分别诱导结直肠癌细胞和干扰了MIF表达的结直肠癌细胞，验证在HHSECs趋化肿瘤细胞迁移的过程中是HHSECs旁分泌的MIF,而非肿瘤细胞来源的MIF起到了关键的作用。 3.HHSECs旁分泌MIF对结直肠癌细胞的生物学影响。 (1)普通光学显微镜观察用培养了HHSECs细胞的条件培养基再培养肿瘤细胞后，细胞形态发生的改变。 (2)运用免疫荧光技术检测HHSECs趋化肿瘤细胞时发生迁移和未发生迁移的细胞是否发生上皮细胞向间质细胞转化(EMT)。 (3)通过免疫蛋白印迹法验证HHSECs外分泌的MIF诱导结直肠癌细胞发生EMT。 结果： 1.肝窦内皮细胞是趋化结直肠癌细胞迁移的关键细胞。 我们先评估是否来自肝脏和非特异性靶器官的正常细胞对CRC细胞迁移是否有不同影响。应用Transwell迁移小室来比较正常细胞对CRC细胞趋化的能力，我们将人类正常细胞放置在下层小室，分别将CRC细胞(SW480，HCT116和LS174T)放置在上层小室。肝脏的正常细胞包括HHSECs，HL7702（人肝细胞）和LX-2（人肝星状细胞）和源自非特异性靶器官的对照细胞如:HUVECs（人脐静脉内皮细胞），293A（人胚胎肾细胞）和BJ（人包皮成纤维细胞）进行比较。该模型模拟了肝血窦内预转移的癌细胞被相邻的细胞趋化的一个过程。 结果表明，HHSECs诱导CRC发生迁移的细胞数量是HUVECs诱导的3-14倍(F=1929.169 P＜0.001)，HL7702、 LX-2、HL7702、293A、LX-2和BJ细胞诱导CRC细胞的迁移的能力同空白对照组并没有显著差异。来源于转移靶器官的细胞，如HL7702和LX-2，对CRC细胞的迁移能力同来自非靶器官的细胞，如293A(F=0.352 P=0.705)和BJ(F=0.071 P=0.931)相比，并没有积极显著的促进作用。 随后，我们将Transwell小室中正常细胞和肿瘤细胞的位置发生对换，置于下层小室的CRC细胞并没有趋化置于上层小室的HHSECs(F=2.717 P=0.052)，HUVECs(F=0.155 P=0.926)，HL7702（(F=56.366 P＜0.001，由于细胞迁移数均数较少，实际比较的意义并不大)和LX-2(F=1.288 P=0.282)发生显著的迁移。此外，当HHSECs、HL7702和LX-2细胞混合培养来诱导CRC细胞迁移时，混合细胞的化学趋化作用并不强于单独用HHSECs趋化。另外，我们也把以转移到肝脏为特定目标器官的肿瘤细胞，HCC1937（人类乳腺癌细胞），作为一个阳性对照，把另一基本不转移到肝脏的肿瘤细胞，RL95（子宫内膜癌细胞）作为阴性对照，用HHSECs、HL7702和LX-2细胞来分别诱导，有趣的是，HHSECs诱导HCC1937(F=687.850 P＜0.001)迁移的能力显著强于RL95(F=1.407P=0.244)，但乳腺癌细胞和子宫内膜癌细胞并没有趋化HHSECs(F=2.753P=0.072)或HUVECs(F=2.533 P=0.087)迁移的能力。因此，Transwell迁移实验证明HHSECs是趋化CRC细胞转移到特定目标器官—肝脏的关键细胞。 2.肝窦内皮细胞旁分泌的MIF是趋化结直肠癌细胞迁移的重要因子。 为了确定HHSECs可能会释放哪些介导因子诱导CRC细胞发生明显迁移，我们收集Transwell上室和下室内的细胞培养上清液（条件培养基），用包含1000种抗体的人类细胞因子阵列检测。我们分析了抗体阵列检测数据发现，MIF、IGFBP-7、Smad4、SPARC、thrombospondin和Ras的表达在HHSECs培养基中显著高于HUVECs和CRC细胞培养基(F=583.395 P＜0.001)。这些蛋白中，HHSECs条件培养基同HUVECs、SW480和HCT116细胞培养基相比，MIF的表达是最高的。两种MIF特异性的抑制剂(ISO-1和p425)能抑制HHSECs诱导的CRC细胞迁移。作为阳性对照，在培养基中加入rhMIF(人类重组MIF)后，CRC细胞的迁移能力明显增强。为了评价HHSECs外分泌的MIF介导肿瘤细胞的趋化作用，我们用慢病毒包装的发夹式RNA(shRNA)干扰HHSECs内MIF的表达。应用实时定量PCR(qPCR)，蛋白免疫印迹(WB)和酶联免疫吸附实验(ELISA)验证干扰细胞内和外分泌MIF表达的效率。 我们发现，Mock/HHSECs条件培养基中加入MIF的抑制剂p425(100 nM)或shMIF/HHSECs条件培养基能抑制HHSECs诱导的迁移作用，但这种抑制作用可以通过补充rhMIF(50 nM)得到恢复。为了阐明HHSECs分泌的MIF还是CRC细胞的MIF在趋化迁移过程中起主要作用，我们干扰了SW480和HCT116细胞内MIF的表达。Mock/HHSECs趋化shMIF/SW480和shMIF/HCT116迁移能力显著强于shMIF/HHSECs和Mock/HHSECs加上p425的诱导作用(F=1653.369 P＜0.001)。我们也运用WB和ELISA检测是否在其他转移性微环境中的细胞也表达或外分泌MIF，包括HL7702、LX-2和HUVECs。HL7702，LX-2和HUVECs在细胞内也表达MIF,但是外分泌少量的MIF。我们运用RT-PCR扩增并检测了MIF在HHSECs、SW480、HCT116和HUVECs中mRNA的编码序列，发现它们的序列是一致的。因此，HHSECs分泌的MIF是介导HHSECs趋化CRC细胞迁移的一个关键因子。 3.肝窦内皮细胞分泌的MIF促进结直肠癌细胞发生EMT，增殖以及凋亡抵抗。 当CRC细胞用HHSECs条件培养基培养后，CRC细胞胞质突起形成海星样的形状。Transwell迁移模型用来展示HHSECs趋化CRC细胞发生迁移的过程中是否发生了EMT。我们发现HHSECs诱导发生迁移的CRC细胞同未发生迁移的CRC细胞相比，强表达间质细胞标志物，如N-钙粘着蛋白(N-ca)和波形蛋白(VIM)，弱表达上皮细胞标志物E-钙粘着蛋白(E-ca)。为了确认EMT的发生是否由HHSECs分泌的MIF介导，我们用各种不同的条件培养基培养CRC细胞24小时，WB检测表明，在包含更多的可溶性MIF的条件培养基中，CRC细胞N-ca和VIM表达增强，E-ca表达减弱。 结论： 1.结直肠癌转移靶器官肝窦内皮细胞是肝内趋化结直肠癌细胞迁移能力增强的关键细胞。 2.肝窦内皮细胞旁分泌的MIF是趋化结直肠癌细胞迁移的关键细胞因子。 3.肝窦内皮细胞旁分泌的MIF促进肝内预转移结直肠癌细胞的趋化和生长。 4.MIF刺激结直肠癌细胞内p-cofilin表达增多与抑制F-actin解聚有关。 5.结直肠癌原发癌MIF的表达与患者预后无关，但与肝内转移瘤的生长相关。
结直肠癌;细胞转移;靶器官;细胞游走抑制因子
南方医科大学
博士
病理学与病理生理学
丁彦青;邓永键
2015
中文
R735.3;R73-37
123
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）