KLF1突变的人群遗传学研究及对β地中海贫血临床表型严重性的遗传修饰作用
背景与目的: 本次研究首次通过分子筛查一个大样本中国人群来调查KLF1基因的突变率与突变谱，并通过表型研究来评估KLF1突变是否对β地贫具有遗传修饰作用。 设计与方法: 一、研究人群、病人和表型检测 本研究通过随机抽样对长期居住在中国南方地区的3918例非亲缘关系个体进行了突变分析，这个大人群队列包括:3839例连续采集的样本和79例表型导向型样本（Hb A2水平:3.3％-4.1％和/或Hb F水平大于1.5％）。与此同时，我们通过采集携带KLF1突变的β地贫患者进行了家系研究，以确认突变是自发突变还是遗传性突变。另外，我们还召集了中国非地贫高发区域的1190例个体作为对照研究，他们来自中国北方地区山东省。 所有的血液学参数均用自动血细胞计数仪测定，血红蛋白组分分析运用高效液相色谱法进行测定。红细胞表面抗原CD44表达量运用流式细胞仪分析。 二、分子遗传检测 DNA提取采用传统的酚/氯仿抽提法。通过高分辨率熔解曲线技术分析（HRM assay）筛查所有参加者的KLF1变异，运用第一代测序对所筛查的变异进行验证。对于KLF1变异是否是功能性突变主要基于两点标准:(1)根据表型的变化:携带者Hb F水平大于1％同时/或红细胞表面抗原CD44表达下降;(2)生物信息学预测:应用 SIFT(http://sift.jcvi.org)和 PolyPhen-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2)软件来预测所发现的KLF1变异是否影响其蛋白质结构和功能。 三、统计分析 所有的统计分析均使用SPSS19.0统计软件或R语言进行，P＜0.05视为具有显著的统计学差异。 结果: 一、中国南方地区人群具有相对高的KLF1突变率 中国南方人群KLF1突变率在队列A，队列B，队列C的突变率分别是:1.27％(25/1971)，1.16％(11/946)，1.30％(12/922)，且这三组之间没有统计学差异，P=0.959，但南方人群KLF1总突变率显著高于北方人群(1.25％ vs.0.08％，P＜0.001)，说明KLF1突变在中国南方人群有相对高的突变频率，且在地中海贫血流行区域更为常见。 二、广泛的KLF1突变谱 3839例连续采集的南方人群样本（队列A，B，C）中共鉴定出48个突变的KLF1等位基因，79例表型导向型样本共发现16个，检出率为20.25％。从突变谱看，p.Gly176AlafsX179和p.His299Asp为最主要的两种突变，占所有突变的90.6％。另外本研究还报道了13种新的中性KLF1变异，包括4种错义突变、4种同义突变和5种3'UTR突变。所发现的这些突变首次展现了KLF1基因人群广泛的突变谱。 三、KLF1突变可改变正常个体血液学参数 通过对41例携带KLF1突变的非地贫人群（25例来自队列A，16例来自队列D）进行血液学分析，发现无论是平均红细胞体积(Mean corpuscular volume，MCV)还是平均红细胞血红蛋白量（Mean corpuscular hemoglobin，MCH）与1946例未携带KLF1突变的非地贫人群相比都轻微的降低了(MCV:82.45±5.39 vs.89.29±4.77 fL,P＜0.001; MCH:26.95±2.11 vs.29.46±1.44 pg,P＜0.001)。另外，这41例个体的Hb A2和Hb F水平也有一定程度的升高，分别为3.28±0.45％和3.44±1.75％。因此，本研究首次通过人群研究发现轻微升高或者处于临界值的MCV和MCH是KLF1基因突变的重要表型，与升高的Hb A2和Hb F这两个已发现的指标一样，可以提高筛查KLF1基因突变的阳性率。 四、KLF1突变可改变β地贫携带者的血液学表型 本研究对14例KLF1杂合突变与β0杂合突变共遗传的个体进行了血液学分析，其中7例β0/βN来自队列B（队列B中1例β+/βN，1例βE/βN，2例β0/βN合并α地贫被排除分析），另外7例β0/βN来自家系样本。意外的是，这14例个体MCV或MCH与217例β0杂合突变携带者相比，并未显得更低，无统计学差异(MCV:63.53±3.94 vs.65.11±4.34 fL，P=0.112; MCH:20.26±1.42 vs.20.34±1.37 pg，P=0.567)。另外一方面，这14例个体显示出了相当高的Hb A2(α262)水平（6.47±0.81％，最低5.10％，最高8.00％），显示出KLF1突变和β-globin基因突变对δ-globin基因表达升高的叠加作用;与此同时，我们注意到这些样本具有升高的且变异的Hb F水平（7.67±4.11％，最低3.60％，最高18.20％），但其变异性有待进一步研究。 五、KLF1突变可减轻β地贫患者临床表型严重性 为了评价KLF1突变对β地贫患者临床表型的修饰作用，我们全面研究了922例β地贫患者的临床表型和目前已知的潜在的减轻β地贫患者临床表型的遗传因素。我们意外的发现2种KLF1突变选择性的出现在12例中间型β地贫患者(TI)中（其中10例携带p.Gly176AlafsX179，2例携带p.His299Asp）。通过Cox比例风险回归模型(Cox proportional hazards model)对8个潜在修饰因素进行评估结果显示，KLF1基因突变对β地贫患者临床表型修饰作用最大(HR=0.213，P＜0.001)，其次是HBB基因型(β+，HR=0.353，P＜0.001)，XmnI(+，HR=0.512，P＜0.001)，HBA突变（HR=0.671，P＜0.001），rs9399137(HR=0.724，P＜0.001) rs766432（HR=0.761，P＜0.001），但性别因素(HR=0.893，P=0.107)和rs11886868（HR=0.871，P=0.415）这2个因素被模型排除。12例TI的基因型中7例是β0/β0+αα/αα，3例β0/β++αα/αα，2例β0/β0+—SEA/αα，我们通过单因素分析[β0/β0，αα/αα，XmnI(-/-)，rs766432(AA or AC)，rs9399137(TT or CT)]比较7例携带KLF1突变和362例无KLF1突变的β地贫患者临床表型，结果显示这7例β地贫患者表现出相对轻的临床表型:较高的Hb水平(82.57±7.81 vs.66.33±17.53 g/L，P=0.006)，较高的Hb F水平（39.58±21.80 vs.9.17土11.05 g/L，P＜0.001），相对少的输血次数（OR=0.082，P=0.007）和较低的TM风险率(OR=0.009，P＜0.001)。Kaplan-Meier无输血生存曲线显示出显著的差异存在这两组中（P＜0.001），其第一次输血的中位时间分别是36个月和6个月。另外，所有携带12例KLF1突变的TI第一次输血的中位时间是48个月，而922例β地贫患者人群中的342例非携带KLF1突变的TI第一次输血的中位时间是24个月，但统计学并未显示出两者间具有差异(P=0.093)，显示出两组TI具有一定的同质性。 结论: 一、本研究首次设计人群遗传学大样本的研究调查出KLF1基因突变在中国南方和中国北方地区的人群突变率，证明KLF1基因突变在地中海贫血流行区域更常见(1.25％ vs.0.08％)。与此同时，鉴定出的64个KLF1突变全面的展现出中国人群广泛的KLF1突变谱。 二、首次通过对携带KLF1突变的非地贫样本和β杂合子样本的基因型与表型样的分析，系统阐明了KLF1突变可以引起MCV和MCH轻微降低或处于临界值，Hb A2水平和HbF水平升高;功能性突变可以使红细胞表面抗原CD44表达降低。这些变异的表型有助于KLF1突变的人群筛查。 三、应用Cox比例风险回归模型全面系统的评估了包括KLF1突变在内的8个因素对922例β地贫患者的临床表型修饰作用，发现KLF1突变可以减轻β地贫患者的临床表型且影响作用最强，对精确诊断β地贫、产前诊断、遗传咨询和基因诊断方面提供了重要依据和线索。
β地中海贫血;kruppel样因子1;基因突变;人群遗传学;临床表型;遗传修饰作用
南方医科大学
博士
遗传学
徐湘民
2015
中文
R556.610.2
121
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）