EMT在非小细胞肺癌EGFR-TKIs获得性耐药中的作用及机制研究
背景和目的： 肺癌是目前世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，已经成为癌症病人死亡的最常见原因。近年来，分子靶向治疗成为研究热点并运用于临床，以吉非替尼为代表的表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factorreceptor-tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs)已经用于EGFR(epidermal growth factor receptor，EGFR)突变型晚期NSCLC的一线、二线治疗，对EGFR野生型NSCLC的有效率也达到5％-6％[1]，然而耐药现象的出现成为制约EGFR-TKIs进一步应用的瓶颈，使使用EGFR-TKIs治疗的患者的中位无进展时间仅为8～10个月[2]。因此，研究和发现EGFR-TKIs获得性耐药机制，积极寻找逆转耐药的新方法具重要的临床意义。 本课题组的前期研究已证实，EGFR野生型的NSCLC细胞H460在EGFR-TKIs获得性耐药过程中发生了EMT，提示EMT可能在EGFR野生型NSCLC获得性耐药过程中起重要作用[9]。上皮间质转化(Epithelial-mesenchymaltransi ion，EMT)，是上皮细胞失去上皮特性，获得间质细胞表型的一种生物现象，发生EMT后，细胞E-钙黏蛋白、角蛋白等上皮标记基因表达降低，波形蛋白、纤维连接素、N-钙黏蛋白等间质标记基因表达升高。EMT与肿瘤细胞的原位侵袭和远处转移、药物耐药有密切关系[10,11]，且与NSCLC的预后[12]及对EGFR-TKIs敏感性密切相关[13-16]。 与基础研究结果一致，E-cadherin表达水平可作为预测NSCLC患者对EGFR-TKIs临床疗效的一个新的生物学标记。一项观察EGFR-TKIs联合化疗治疗NSCLC的国际多中心随即Ⅲ期临床研究结果显示:E-cadherin表达阳性的患者疾病进展时间明显延长[23]。吉非替尼一线治疗NSCLC，E-cadherin表达阳性的患者总生存显著长于E-cadherin表达阴性的患者[24]。 多种转录因子密切参与了EMT的发生，目前发现Snail、Slug、Twist、ZEB1、Smad、NF-B等[25]。研究发现，EMT相关转录因子(ZEB1、slug)在吉非替尼获得性耐药的过程中也起到关键性的调控作用，靶向消除Slug的表达能逆转耐药细胞株的间质化特征，恢复耐药细胞株对吉非替尼的敏感性[26]。对于NSCLC细胞发生EMT后EGFR-TKIs治疗敏感性下降的分子细胞学机制目前尚未阐明。 因此，在课题组前期工作的基础上，本课题拟通过构建靶向CDH1基因的过表达慢病毒表达载体感染EGFR野生型和突变型NSCLC细胞，提高E-cadherin的表达水平，逆转细胞的EMT，观察耐药细胞对EGFR-TKIs的敏感性变化，探讨EMT在NSCLC细胞对EGFR-TKIs产生获得性耐药中的作用及其可能的分子学机制，为提高EGFR-TKIs疗效寻找新靶点和新方法。 方法： 1、选用EGFR突变型的人肺腺癌细胞PC/9及其吉非替尼耐药细胞PC9/AB。高分辨率溶解曲线分析技术(Quantitative PCR high-resolutionmelting，qPCR-HRM)检测PC9/AB细胞EGFR及Kras基因突变;MTT法检测两组组细胞的增殖情况;划痕实验和Transwell实验检测细胞转移和侵袭能力的改变; Western blot方法检测两组细胞的EGFR、p-EGFR、E-cadherin、Vimentin、Snai l等的蛋白水平的表达变化。 2、利用GV218质粒构建靶向CDH1（NM-004360）（E-cadherin基因）的过表达载体和阴性对照载体，并用PCR电泳鉴定和基因测序;经过鉴定测序的构建好的载体质粒转染293T细胞，用Western Blot外源筛选有效过表达载体;选择转染效果良好的慢病毒载体进行包装并测定滴度。 结果： 1、PC9/AB细胞和H460/ER细胞的EGFR和K-ras基因突变状况 基因突变检测结果显示，PC9/AB细胞为EGFR基因19号外显子缺失突变型及K-ras基因野生型，无T790M突变及cMET基因扩增。前期研究结果显示，H460/ER细胞为EGFR基因及K-ras基因野生型。 2、PC9/AB细胞对EGFR-TKIs敏感性下降 MTT法检测结果显示，PC9、PC9/AB细胞均呈无限繁殖。PC9/AB细胞对吉非替尼的增殖作用显示为浓度依赖性作用，PC9/AB细胞对厄洛替尼的敏感性较PC9细胞显著下降，IC50值分别为7.23±6.89μ mol/L和0.04±0.00μ mol/L(P＜0.05)。该结果说明，PC9/AB细胞对EGFR-TKIs产生了获得性耐药。 3、PC9/AB细胞的形态学变化 PC9/AB的细胞形态改变与PC9细胞相比，PC-9/AB细胞形态倾向梭形发展，细胞间连接变得更加疏松，符合间质细胞形态学表现。 4、PC9/AB细胞的迁移及侵袭能力变化划痕实验结果显示，PC9/AB划痕两边缘距离均明显缩短。侵袭实验结果显示，PC9/AB穿过Matrigel胶的细胞数明显高于原亲本细胞。 5、PC9/AB的EMT相关分子和EGFR在蛋白表达的变化 western blot结果显示，vimentin、snail的蛋白表达水平均明显增加，差异均有统计学意义(P＜0.05)。EGFR、E-cadherin、β-catenin的蛋白表达水平明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。以上结果表明，PC9细胞发生获得性耐药后，发生了EMT，且EGFR及其磷酸化蛋白表达降低。 6、CDH1基因慢病毒过表达载体的构建 针对CDH1基因成功构建了2条过表达慢病毒载体LV-CDH1(5386-1)-P1、LV-CDH1(5386-1)-P2以及阴性对照载体CON136; q-PCR法外源筛选出有效过表达慢病毒载体LV-CDH1(5386-1)并进行病毒包装，获得了较高滴度的慢病毒颗粒;感染结果显示该慢病毒载体能稳定高效转染H460/ER和PC9/AB细胞。Q-PCR方法Western blot结果表明LV-CDH1(5386-1)慢病毒对H460/ER细胞的CDH1基因的mRNA水平提升了约16倍，蛋白表达水平明显升高，LV-CDH1(5386-1)慢病毒对PC9/AB细胞的CDH1基因的mRNA水平提升了约4倍，蛋白表达水平明显升高。 7、高表达E-cadherin后的H460/ER和PC9/AB细胞形态变化 与阴性对照细胞相比，PC9/AB-CDH1、H460/ER-CDH1细胞形态倾向椭圆形发展，细胞间连接变得紧密，符合上皮细胞形态学表现。 8、高表达E-cadherin后细胞的迁移和侵袭能力变化 划痕实验结果显示，与阴性对照细胞相比，PC9/AB-CDH1、H460/ER-CDH1细胞的划痕两边缘距离均明显增宽。侵袭实验结果显示，阴性对照细胞穿过Matrigel胶的细胞数明显高于PC9/AB-CDH1、H460/ER-CDH1细胞。以上结果表明，高表达E-cadherin后，PC-9/AB和H460/ER细胞的细胞侵袭和迁移能力均明显降低。 9、高表达E-cadherin后细胞EMT相关分子的蛋白水平变化 与阴性对照细胞相比，PC9/AB-CDH1、H460/ER-CDH1细胞的vimentin、snail的蛋白表达水平均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）;E-cadherin、β-catenin的蛋白表达水平均明显增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。以上结果表明，高表达E-cadherin后，细胞发生了去EMT的变化。 10、高表达E-cadherin后细胞对EGFR-TKIs的敏感性变化 MTT结果显示，PC9/AB-CDH1、H460/ER-CDH1细胞均呈无限繁殖。吉非替尼(0.01～10μmol/L)可抑制PC-9/AB-CDH1细胞生长，该抑制作用呈浓度依赖性;PC9/AB-CDH1与阴性对照细胞相比，对吉非替尼的敏感性增加约11.4倍，IC50值分别为(0.70±0.22)μmol/L和(8.68±0.44)μmol/L，差异有统计学意义（P＜0.05）。厄洛替尼(10～100μmol/L)可抑制H460/ER-CDH1细胞生长，该抑制作用呈浓度依赖性;H460/ER-CDH1与阴性对照细胞相比，对厄洛替尼的敏感度增加约6.1倍，IC50值分别为(7.51±1.12)μmol/L和(53.72±12.95)μmol/L，差异有统计学意义（P＜0.05）。 11、高表达E-cadherin后细胞EGFR基因蛋白水平上的变化 western blot结果显示，EGFR、p-EGFR蛋白表达水平均明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。 结论： 本研究发现: NSCLC细胞在产生EGFR-TKIs耐药的过程中出现了EMT。逆转耐药细胞的EMT可提高NSCLC对EGFR-TKIs的敏感性，上皮间质转化在NSCLC对EGFR-TKIs的获得性耐药中起重要作用，其机制可能与EGFR磷酸化水平降低有关。
非小细胞肺癌;上皮细胞向间质细胞转化;获得性耐药;表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂
南方医科大学
硕士
肿瘤学
张为民
2015
中文
R734.2;R730.231
97
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）