激光共聚焦内镜结合荧光标记的脂肪酸特异检测大肠癌
研究背景： 代谢是生物体内发生的用于维持细胞生长、增殖和分化等生命活动的反应进程。多数肿瘤的代谢与正常细胞存在很大差异，正常细胞依赖葡萄糖有氧氧化、脂肪酸β氧化供能，而在肿瘤中，即使氧气供给充足，肿瘤细胞很少进行葡萄糖有氧氧化过程，反之，其对外界葡萄糖的吸收大大增加且产生大量乳酸，这种以糖酵解为主的代谢方式也称为“Warburg效应”。 脂肪酸是机体许多器官的重要能量来源，可由食物供给和内源性的合成产生，脂肪酸合成(FASN)增加被称为肿瘤代谢的另一重要标志，其与糖酵解过程密切相关。肿瘤细胞的脂肪酸代谢途径异常，正常情况下，细胞吸收外源性的脂肪酸并将其转化为甘油三酯，以提供机体的能量储备。 结肠癌是发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤，在全球女性癌症相关死亡率中位居第三，男性中位居第四，2008年全球因结肠癌死亡人数为608，700，过去认为主要由基因突变所致，近年来，随着环境改变和人们不均衡的膳食模式等原因，其发病率不断增长，已成为我国发病率升高最快的恶性肿瘤之一。肿瘤治疗的关键在于早期发现，如果能在肿瘤发展早期作出相应的判断和检测，50％以上的恶性肿瘤可以治愈，5年生存率可达80-90％。结肠癌早期因其组织的结构和功能未出现明显变化，诊断仅依赖临床医师的经验和肿瘤宏观形态学、血清肿瘤标志物、影像学、病理学等手段，敏感度和特异度较低。内镜被认为是结肠癌早期诊断最有效的方式。普通内镜对早期胃肠癌的诊断率低，新兴的内镜如染色内镜、放大内镜、超声内镜等明显提高了早期胃肠道肿瘤的检出率。 超声内镜将内镜和超声波结合于一体，行内镜检查同时，使用超声对待观察部位进行定点探测，可知病变侵润的深度、血管累及情况及与周围脏器的关系。其在胰腺癌的诊断、胰腺假性囊肿穿刺治疗方面有着其他内镜不可比拟的优势。 激光共聚焦内镜(CLE)是一种新型的内镜技术，它是传统电子内镜和激光共聚焦显微镜整合的产物，在内镜检查同时，还能进行共聚焦显微镜检查，通过放大扫描检查的组织1000倍，对细胞和亚细胞结构进行观察，被称为“光学显微镜”。共聚焦内镜成像主要依靠荧光对比剂的存在，运用较多的为荧光素钠和盐酸吖啶黄，荧光素钠是一种廉价、无致突变性的对比剂，静脉注射荧光素钠数十秒后，共聚焦内镜下即可清晰显示细胞轮廓和排列方式，其成像范围可从上皮表面深入至固有层，然而荧光素钠并不富集于细胞核，不易观察到细胞核形态，对病变的良恶性判别构成很大干扰，且其可引起不良反应如过敏反应、恶心、呕吐、眩晕等。 荧光基团标记的脂肪酸BODIPY-FA(C22H31BF2N2O2)是天然脂肪酸的类似物，其分子量为404，具有亲脂性，激发/发射波长为500/510nm能被488nm的氩离子激光器激活，目前主要运用在脂肪酸转运的研究中，可于流式细胞仪及共聚焦显微镜下观察。 研究目的： 在共聚焦内镜下，于不同肠癌模型的小鼠肠道局部给予BODIPY-FA染色，分析不同病变性质的组织对BODIPY-FA的吸收情况，比较不同染色剂对于肿瘤诊断的效能，同时探讨肠癌中脂肪酸吸收减少的相关机制。 研究方法： 1、流式细胞仪检测BODIPY-FA在肠癌细胞株中的吸收曲线及其与硬脂酸的吸竞争抑制作用 (1)将不同的结肠癌细胞株以相同密度600，000个/孔培养于六孔板中，分别加入1ml的1uM BODIPY-FA工作液，恒温箱内放置10秒，30秒，1分钟，2分钟，5分钟，10分钟6个时间点，吸去BODIPY-FA，0度冰PBS终止反应并清洗，经消化、离心后，流式细胞仪检测各时间点不同细胞对BODIPY-FA的荧光吸收值。 (2)将不同的结肠癌细胞株以相同密度600，000个/孔培养于六孔板中，用1uM的BODIPY-FA工作液和浓度分别为0.15uM、1.5uM的硬脂酸混合液等体积混合，分别加入1ml上述不同混合液，无硬脂酸的为对照组，恒温箱中放置10分钟，0度冰PBS终止反应并清洗，经消化、离心后，流式细胞仪检测各实验组BODIPY-FA的荧光吸收值。 2、构建动物模型 (1) AOM/DSS化学诱导结肠癌模型 选取年龄为6周的Balb/c雄鼠，腹腔注射AOM12.5mg/kg后，正常饮水7天，于第2周予3％DSS连续7天，然后正常饮水连续14天，此为一个循环，即连续给予3％DSS7天，而后休息14天，总共三个循环。最后一个循环结束建模完成，不再给予DSS，我们前期的实验结果发现:癌变的肠段（多靠近直肠）可出现肉眼可见的肠壁增厚、僵硬，能较好的提示肿瘤所在位置并进行染色处理。分批次提取老鼠，可直接处死小鼠进行组织染色的观察和切片，也可进行后续的活体实验。 (2) APC-min小鼠 年龄为6-7周的APC-mm雄鼠购自南京大学模式动物中心，为自发的肠道腺瘤模型，购买6-8周雌鼠与之交配，待繁殖数量较多的小鼠并DNA鉴定后，可直接处死小鼠进行组织染色的观察和切片，也可进行后续的活体实验。 (3)裸鼠肠道移植瘤模型 选取年龄为6周的Balb/c裸鼠。取处于对数期生长期的肠癌细胞株LOVO大批量传代，经消化、计数、离心后，弃上清收集细胞沉淀。在严格无菌条件下，以外科手术方式，用29g的微型注射器将细胞沉淀（每次细胞个数约106）注射入结肠浆膜层，注射成功的浆膜层可见局部圆形白色的隆起，有时可沿管壁呈纵形。关闭腹腔，表面消毒。约3-4周后移植的LOVO可突破肌层到达粘膜下层甚至粘膜层。 3、动物实验（实验过程避光进行） (1)将肠癌模型的小鼠禁食12小时，以保证肠道清洁，用戊巴比妥0.01g/ml，剂量为6-7ul/g小鼠体重，腹腔注射麻醉，采用外科手术方式暴露腹腔，间断分离2段长约1cm的结肠，以手术缝线结扎肠段两端，结扎程度松紧适宜，以荧光染料不能通过结扎口，又不影响肠管血运为佳。用注射器吸取100ul的染色剂注射入结扎好的肠段内，小鼠分3组，染色剂分别为200uMBODIPY-FA、0.02％吖啶黄、500uM2-NBDG。10分钟后拆除缝线并冲洗，可将染色部分的肠管剪取行快速冰冻切片，也可运用共聚焦内镜在体观察。 (2)将共聚焦内镜的激光能量和亮度固定，于上述小鼠荧光剂局部染色10分钟后，将染色部位冲洗干净，共聚焦内镜探头与肠粘膜层紧密接触，每个部位观察时间不超过20秒。内镜医师根据共聚焦成像判断探测部位的性质，实验者用29g注射器（吸取印度墨汁）准确标记经内镜医师判断过的病变部位。标号后的组织冰冻切片，HE金标准结果和共聚焦内镜诊断一一对应。 研究结果： 1、BODIPY-FA在肠癌细胞内的吸收及与硬脂酸竞争情况 不同细胞株对BODIPY-FA的吸收存在差异，SW480对BODIPY-FA的吸收量最多，而LOVO和HCT116对其吸收相对较少。在10分钟内，SW480、LOVO、HCT116细胞吸收BODIPY-FA呈不断增长曲线提示其在细胞内不断蓄积，而HT29在10分钟可见下降趋势。此实验探索了贴壁细胞对BODIPY-FA染色的最佳时间，为后续的动物在体染色实验提供参照。 在BODIPY-FA与硬脂酸(C18∶0)的吸收竞争实验中，浓度为0.15uM和1.5uM的硬脂酸能不同程度的抑制细胞对BODIPY-FA的吸收，这种抑制效应在SW480中最为显著。实验证明BODIPY-FA与硬脂酸共同竞争细胞膜上的脂肪酸转运蛋白，其为脂肪酸的类似物，可作为游离脂肪酸的替代物进行生物体内代谢情况的研究。 2、Caveolin-1和CD36在人结肠癌组织中表达降低 荧光定量PCR检测配对的人结肠癌患者正常和肿瘤组织中mRNA的表达。CD36mRNA在肿瘤组织中表达量显著低于正常黏膜。caveolin-1 mRNA在肠癌组织中表达量较正常组织降低（肿瘤:0.1031±0.04203，正常:0.4381±0.1129，P＜0.005)。余FABPpm、FATP4mRNA在肿瘤和正常组织中表达无明显差异。 免疫组化检测人结肠癌配对标本中Caveolin-1和CD36的蛋白表达情况，结果示:Caveolin-1主要于胞膜和胞浆中表达，在血管和基质细胞内也可检测到表达，Caveolin-1于肿瘤中的表达较正常组织明显降低，P=0.0024。 研究结论： 通过上述实验结果，我们得出以下结论: 1、BODIPY-FA为脂肪酸的类似物，在短时间内可于细胞内不断蓄积。 2、相比其他对比剂，BODIPY-FA通过相对“暗区”特异地显示肿瘤位置，具有高特异性。 3、BODIPY-FA染色后能够对所病变进行细胞、亚细胞水平的描述，成像清晰，辨析度高。 4、在活体共聚焦使用中仅需局部染色，无毒性反应，方法快速、安全、便捷。 5、人结肠癌组织中Caveolin-1和CD36的mRNA和蛋白表达显著降低，肿瘤对BODIPY-FA的吸收减少可能基于此原因。 我们通过构建小鼠肠癌模型并在体实验发现，肿瘤组织对于BODIPY-FA的吸收明显减少，其分子机制可能与Caveolin-1和CD36低表达相关，同时BODIPY-FA与共聚焦内镜的结合实现了肿瘤特异示踪及细胞内成像，有助于病变的实时定位、定性。本研究为临床实践及科研工作提供了发现早期肿瘤的新思路，具有重要的价值。
结肠癌;激光共聚焦内镜;荧光标记;脂肪酸;诊断价值
南方医科大学
硕士
内科学（消化系病）
姜泊;聂飚
2015
中文
R735.35;R730.41
73
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）