MiR-128a在肝细胞癌发生发展中的作用及其机制的探讨
背景及目的： 肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球最常见的恶性肿瘤之一，发病率逐年增长，己超过74.8万/年，居于恶性肿瘤的第5位;死亡接近70万/年，位居肿瘤相关死亡的第2位。世界上一半以上的肝癌新发病例发生在中国。在我国大多数肝癌患者起病隐匿，早期几乎无明显症状，但病情进展迅速，确诊时大多数患者已经达到局部晚期或发生远处转移，治疗困难且预后很差。目前虽然在早期诊断、肝移植和早期肝癌切除术方面取得了重要进展，但HCC却是仅次于肺癌的第二大癌症杀手。因此，肝癌严重危害我国人民的健康和生命。 越来越多的研究表明:肝癌的发生发展是一系列复杂、多步骤的连续过程。其中抑癌基因与癌基因表达失调是肝癌发生发展的重要一环，如抑癌基因TP53、AXIN1/2、APC、PTEN等的失活或表达量降低以及癌基因β-catenin、TGF-β、c-myc等的激活或表达量的增加与肝癌的发生发展密切相关。虽然如此，这些基因却还不能作为肝癌早期诊断和预后判断有效的分子标志物。因此，寻找可以辅助肝癌早发现、早诊断、精准治疗及判断预后的分子标志物以及研究肝癌发病的分子机制仍是肝癌研究的重要内容。 MicroRNAs(miRNAs)是一群高度保守的小片段非蛋白编码RNA分子，长度为18至25个核苷酸，在基因转录后水平调控中发挥重要作用。越来越多的研究表明miRNAs在许多生理过程中发挥着重要作用，miRNAs通过与其靶基因相互作用在机体内组成一个复杂的调控网络，对生物体的生长、发育、分化、增殖、凋亡、免疫活动和疾病发生过程等进行精确调控。近年来研究发现，miRNAs的突变或失调与人类多种肿瘤相关，这些差异表达的miRNAs调控肿瘤发生发展相关基因的表达，参与细胞分化、增殖、细胞凋亡和血管生成等生物学过程的调控，可能代表肿瘤的生物特性的改变，而且差异表达miRNAs可作为肿瘤诊断、治疗及预后判断的分子标志物。 微小RNA-128(miR-128)是一种在正常脑神经系统中高表达的miRNA，在神经系统的发育及正常生理功能的维持中发挥重要作用。有研究显示，miR-128在神经系统肿瘤、乳腺癌和前列腺癌等肿瘤中表达下调，并通过其靶基因如促癌基因Bmi-1，EGFR，p70S6K1，E2F3a等发挥抑癌作用。近年研究证实，miR-128的失调与肿瘤的发生发展密切相关，miR-128在多种肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡、侵袭和转移等过程中发挥重要作用。其表达的失调还与骨肉瘤、直肠癌等肿瘤患者的临床预后相关，并与宫颈癌患者对顺铂化疗耐药情况相关。而在胶质瘤中，miR-128可促进脑胶质瘤患者替莫唑胺化疗敏感性增加。上述的研究结果预示着miR-128可能成为具有潜在价值的重要肿瘤标志物，与肿瘤诊断、治疗和预后相关，并有望成为肿瘤治疗的新靶点。 本研究首先应用qRT-PCR方法检测miR-128a在肝细胞癌组织和对应癌旁组织中的表达水平的变化。然后通过MTT方法检测经miR-128a mimic或inhibitor转染后肝癌细胞增殖活力变化，探讨miR-128a在肝癌细胞中的生物学功能，进而通过软件预测、双荧光素酶试验、qRT-PCR及Western blot阐明了其在肝癌发生发展过程中可能的作用机制。最后应用qRT-PCR方法检测62例肝癌组织中miR-128a的表达，分析其表达与肝癌预后、临床病例参数之间的关系，明确miR-128a能否成为判断肝癌预后的分子靶标，为进一步寻找肝癌早期诊断、预后判断、确定治疗决策的新的分子标志物及靶向治疗提供了理论依据。 方法： 1、肝癌组织及对应癌旁组织中miR-128a表达水平的分析 利用qRT-PCR方法检测来自19例患者的肝癌组织及其对应癌旁组织中miR-128a的表达水平。采用配对t检验的方法比较肝癌组织及其癌旁组织中miR-128a的表达水平有无差异。所有肝癌组织均为术后新鲜标本，诊断经病理证实。 2、miR-128a在肝癌细胞中的生物学功能及其促进肝癌细胞增殖的作用机制 运用阳离子脂质体LipofectaminTM RNAiMAX介导miR-128a inhibitor或mimic转染肝癌细胞株，然后采用TRizol法提取肝癌细胞RNA，并采用qRT-PCR的方法鉴定转染后miR-128a在肝癌细胞中的表达;接着利用MTT法测定转染前后肝癌细胞增殖能力的变化。最后我们用TargetScan Human6.2，miRanda，PicTar等公用在线软件对miR-128a的靶基因进行预测，选出两个以上软件同时预测到的靶基因，结合miR-128a促进肝癌细胞增殖的生物学功能，选出miR-128a可能的靶基因RND3，采用双荧光素酶基因报告系统验证miR-128a和RND3之间相互作用。并在肝癌细胞中过表达或干扰miR-128a后，利用qRT-PCR及Western blot方法检测RND3及凋亡相关蛋白表达量的变化。 3、miR-128a表达水平在肝癌中的作用意义 利用qRT-PCR方法检测62例肝癌石蜡组织标本中miR-128a的表达水平，应用Kaplan-Meier生存分析法分析miR-128a对肝癌预后的影响;采用Spearman秩相关分析miR-128a表达与肝癌各临床病理参数之间的相关性;运用COX比例风险回归模型对各临床病理参数、miR-128a表达与肝癌预后的关系进行单因素与多因素分析，明确miR-128a是否可以作为肝癌发病的独立风险因素。 结果： 1、肝癌组织及对应癌旁组织中miR-128a表达水平的分析 我们用qRT-PCR方法检测了在19对肝癌组织及其对应癌旁组织中miR-128a的表达水平，采用配对t检验的方法比较肝癌及其对应癌旁组织miR-128a的表达水平有无差异。结果表明肝癌组织中miR-128a表达水平高于肝癌癌旁组织中miR-128a表达水平，差异有统计学意义(P＜0.05)。 2、miR-128a在肝癌细胞中的生物学功能及其促进肝癌细胞增殖的作用机制 采用miR-128a mimic或inhibitor转染肝癌细胞后，运用qRT-PCR方法检测转染效率，结果提示肝癌细胞miR-128a表达水平在转染miR-128a mimic组中相应升高，而在转染miR-128a inhibitor组中相应下降，差异有统计学意义（P＜0.01）;运用MTT法检测肝癌细胞增殖能力，结果发现在肝癌细胞中miR-128a过表达后，肝癌细胞的增殖能力明显增加，相反当对肝癌细胞miR-128a干扰表达后，肝癌细胞的增殖能力下降(P＜0.001)。接着用TargetScan Human6.2，miRanda和Pic Tar等公用在线软件对miR-128a的靶基因进行预测，结果发现，在TargetScan Human6.2和miRanda两个软件中可同时预测到RND33'UTR区存在与miR-128a的保守作用位点。我们进一步应用双荧光素酶基因报告试验进行验证miR-128a与RND33'UTR之间的相互作用，结果表明，在RND33，UTR野生型组中，转染了miR-128a的肝癌细胞的荧光素酶活性较转染nc组肝癌细胞的荧光素酶活性降低，差异具有统计学意义(P＜0.01)。而在RND33'UTR突变型组中无明显变化。这些结果证明miR-128a可直接作用于RND33'UTR区。另外，在肝癌细胞中过表达miR-128a后，RND3 mRNA水平及蛋白水平均相应减少，而在肝癌细胞中干扰miR-128a表达后，RND3 mRNA水平及蛋白水平均相应增加，这进一步证实miR-128a靶向调控RND3促进肝癌细胞增殖。我们在肝癌细胞中抑制miR-128a表达后，采用Western blot方法检测凋亡相关蛋白，结果发现cyclin B1，cyclin D1和CDK4的表达下调，这些结果提示miR-128a促进肝癌细胞增殖可能是通过靶向调控RND3进而影响细胞周期进展来实现的。 3、miR-128a在肝癌中作用意义 我们应用qRT-PCR方法检测了62例肝癌石蜡标本中miR-128a的表达情况，再应用Spearman秩相关分析miR-128a的表达情况与肝癌临床病理参数之间的关系，结果发现miR-128a表达只与AST密切相关，而与性别、年龄、肿瘤大小、病理分级、肝癌巴塞罗那分期、门脉癌栓、肿瘤数目、远处转移、血清AFP、肝硬化、HBS-Ag、ALT、ALB及肿瘤复发均无显著相关性。生存分析发现无论肝癌患者有无复发，miR-128a的表达均未发现与肝癌患者的预后显著相关。COX比例风险回归模型对各临床病理参数、miR-128a表达与肝癌预后的关系进行单因素与多因素分析，只发现AST及肝癌巴塞罗那分期为肝癌的危险因素。 结论： 1、miR-128a在肝癌组织中的表达普遍增高，可作为诊断肝癌的一个有价值的分子标志物。 2、miR-128a在肝癌细胞中可以通过靶向调控RND3促进肝癌细胞增殖。 3、miR-128a在肝癌中高表达，但尚未发现其与肝癌患者预后及临床病理特征相关。
肝癌;非编码核糖核酸-128a;细胞增殖;发病机制
南方医科大学
硕士
肿瘤放射治疗学
吴德华
2015
中文
R735.7;R730.231
87
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）