Disulfiram联合Cu对急性B淋巴细胞白血病细胞的杀伤作用及其分子机制的探讨
研究背景:急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是儿童最常见的恶性肿瘤之一，也是成人常见的急性白血病类型之一，发病年龄有两个高峰期，即2至5岁的儿童和大于50岁的成人。ALL是一种起源于B或T系淋巴干祖细胞的异常克隆性疾病，在临床、细胞遗传学及分子生物学均具有高度异质性。 双硫仑(Disulfirum，DS)是一种临床上应用60多年的抗酗酒药物，具有安全性好、毒副作用小且价格低廉等多种特性。近年来，越来越多的研究者发现DS对乳腺癌、脑胶质细胞瘤、前列腺癌、黑色素瘤及结肠癌等多种实体瘤具有抗肿瘤作用。进一步研究还表明DS是一种强的金属离子螯合剂，能够与多种金属离子结合如Zn、Cu和Ni等形成复合物而增强其肿瘤杀伤作用。Cu是生物有机体一种必需的微量元素，其对于机体内许多关键酶和转录因子活性的发挥具有至关重要的作用。许多研究发现，DS与Cu结合形成Cu(deDTC)2复合物能够增强DS的肿瘤杀伤作用。虽然目前许多研究者已经证实了DS/Cu对许多恶性肿瘤包括实体瘤和血液系统恶性疾病具有明显的诱导凋亡和抑制增殖作用，但关于其对急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞作用的相关报道却很少。由于ALL80-85％起源于B细胞，因此本研究将探讨DS联合Cu对B-ALL细胞（包括原代BALL细胞和Nalm6细胞株等）的杀伤作用及其分子机制。 细胞凋亡(Apoptosis)又称程序性细胞死亡(Programmed Cell Death，PCD)，是指由基因调控的细胞自主有序的死亡，对于维持内环境的稳定、多个系统的发育以及生物进化等过程中起着重要作用。机体内主要存在有三条途径，一条是死亡受体介导的凋亡通路（又称外源性凋亡通路），另外一条是线粒体相关的凋亡通路（内源性凋亡通路），最后是内质网通路，其中线粒体凋亡通路被认为是最经典的凋亡途径。线粒体是细胞生命活动控制中心，它既是细胞呼吸和氧化磷酸化的中心，又是细胞凋亡的调控中心。线粒体介导的细胞凋亡主要是由于各种刺激的作用（包括阴性和阳性刺激两大类，阴性刺激因子主要指的是由于各种生长因子、激素和细胞因子的缺乏所致;阳性刺激包括射线、药物、细胞毒素、缺氧及病毒感染等多种因素）使线粒体内膜上的通透性转换孔道-线粒体通透性转换孔（Mitochondrial permeability transition pore，MPTP）开放，导致线粒体膜通透性发生改变、线粒体膜电位(mitochondrial membrance potential，MMP/△Ψ)下降，从而使线粒体膜间隙(mitochondrial intermembrane space，IMS)存在的大量的凋亡相关因子释放至胞浆或胞核内，包括细胞色素C、Smac/DIABLO、Htra2/Omi、IAPs、AIF及核酸内切酶G(EndoG)等，从而诱导Caspases家族蛋白酶的活化，随后Caspases切割其底物蛋白（这些蛋白大多是细胞内的功能蛋白，在DNA修复、mRNA裂解、类固醇合成及细胞骨架重建等过程中起着重要的作用），并使这些作用底物蛋白的功能丧失，最终导致细胞凋亡。 Bcl-2家族蛋白根据其功能和BH结构域数目的不同而分成三大亚类:1)抗凋亡蛋白亚家族:是指具有4个BH结构域(BH1-4)的Bcl-2和Bcl-xL;2）促凋亡蛋白亚家族:指其蛋白结构中包含有3个BH结构域(BH1-3)的BAX和BAK等;3）仅具有BH3结构域的促凋亡蛋白亚家族:如BID和BIM。这三类Bcl-2亚家族蛋白之间相互可形成同源或者异源二聚体，形成的二聚体是其家族蛋白之间功能实现和功能调节的重要形式。大量的实验研究表明Bcl-2家族蛋白在调控线粒体膜电位的变化中发挥着重要的的作用，从而在调控细胞凋亡作用方面发挥着不可或缺的角色。Bcl-xL、Bcl-2蛋白同属于Bcl-2抗凋亡蛋白亚家族，两者在细胞抗凋亡作用方面起着协同作用，共同抑制细胞凋亡，延长细胞寿命。Bcl-2基因（即B细胞淋巴瘤/白血病-2基因）是一种原癌基因(oncogene)，最早是由Tsujimoto Y等于1984年在滤泡性非霍奇金淋巴瘤(Follicular non-hodgkin's lymphoma)患者中首先发现的，是由于t(14;18)(q32;q21)染色体异位所致，其编码的Bcl-2蛋白是体内最重要的抗凋亡蛋白之一。 目前关于DS/Cu抗肿瘤作用的分子机制尚不完全明确，大部分研究主要围绕蛋白酶体抑制和JNK/c-Jun通路的活化等方面，其他还包括抑制血管生成、Ras/PI3K/mTOR通路及抑制MDR蛋白等多方面。本研究团队前期也已经证实了DS/Cu可通过抑制NF-κB、活化JNK/c-Jun通路、诱导ROS在细胞内蓄积从而诱导急性髓系白血病KG-1a细胞、急性T淋巴细胞白血病Molt4细胞和Brukitt淋巴瘤Raji细胞凋亡并抑制其增殖，且能逆转HL-60耐药细胞株对多柔比星的耐药。目前有关DS/Cu对于急性B淋巴细胞白血病细胞的杀伤作用及其分子机制的研究尚少，有研究报道发现线粒体凋亡通路(mitochondrialpathway)在DS/Cu诱导其他肿瘤细胞凋亡及抑制增殖过程中发挥着重要的作用，因此本研究将以B-ALL细胞株(Nalm6细胞)和原代B-ALL细胞为研究对象，探讨DS/Cu对急性B淋巴细胞白血病细胞细胞Nalm6及原代B-ALL细胞的杀伤作用及其与线粒体凋亡通路之间的关系。 研究目的:本实验以急性B淋巴细胞白血病Nalm6细胞株、原代B-ALL细胞为研究对象，探讨DS/Cu是否能诱导急性B淋巴细胞白血病细胞凋亡并抑制其增殖;并进一步研究DS/Cu诱导急性B淋巴细胞白血病细胞凋亡与线粒体凋亡通路之间的关系。 研究方法:1、用CCK-8(cell counting kit-8)法检测不同浓度的(0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4uM) DS联合0.5uM的Cu作用24h后对Nalm6细胞的增殖抑制作用，并用graph prism5软件计算出相应的IC50值。 2、用Annexin-Ⅴ/PI双染法流式细胞术检测不同浓度的(0.025、0.05、0.1、0.2、0.5uM) DS联合0.5uM的Cu处理24h后对Nalm6、原代B-ALL细胞凋亡的影响。 3、用甲基纤维素集落形成（colony-forming unit，CFU）实验检测DS及DS/Cu对Nalm6细胞集落形成能力的影响; 研究结果:1、CCK-8细胞毒性实验结果显示DS/Cu对Nalm6细胞具有明显的增殖抑制作用:作用24h后，单药Cu(0.5uM)组的增殖抑制率为(6.39±4.93)％，与对照组比较差异无统计学意义（t=-2.244，P=0.088）。而不同浓度的DS/Cu对Nalm6细胞均具有显著的增殖抑制作用，且呈剂量依赖性，0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4uM的DS联合0.5uM的Cu对nalm6细胞的增殖抑制率分别为(22.29±6.69)％、(48.66±11.58)％、（50.83±12.61）％、（59.24±9.43）％、(62.74±9.17)％、（66.7±7.64)％、（72.13±7.94)％、（77.86±5.43)％，单因素方差分析表明与对照组比较差异均具有统计学意义（均P＜0.05），由graph prism5软件计算24h的IC50浓度为（0.18±0.08）uM。 2、流式细胞术Annexin-Ⅴ/PI双染法检测细胞凋亡的结果显示DS/Cu对Nalm6细胞具有显著的凋亡诱导作用:单药Cu(0.5uM)组作用于Nalm6细胞24h后凋亡比例为（7.82±5.13）％，与对照组(8.34±6.23)％相比差异无统计学意义（t=0.112，P=0.916）。而不同浓度的(0.025、0.05、0.1、0.2、0.5uM)DS联合0.5uM的Cu对Nalm6细胞具有显著的凋亡诱导作用，凋亡比例分别为(17.84±7.68)％、（31.39±5.86)％、(60.41±13.87)％、（69.26±13.29)％、（81.37±12.72）％，经单因素方差分析表明，不同浓度DS/Cu均能诱导Nalm6细胞凋亡，与对照组（8.34±6.23）％比较差异具有统计学意义(F=28.471)。进一步用LSD方法比较不同浓度DS/Cu两两组间的细胞凋亡比例的差异结果显示:0.025uM组与0.1、0.2、0.5uM组间均有明显的统计学差异（均P＜0.01）;0.05uM与0.1、0.2、0.5uM组间差异具有显著统计学意义（均P＜0.01）;0.1uM与0.5uM组间差异也具有明显统计学意义（P＜0.05）;余各组间差异无统计学意义。 研究结论:1、不同浓度的DS/Cu对Nalm6细胞具有显著的增殖抑制作用，且呈剂量依赖性，24h的IC50为(0.18±0.08) uM。 2、不同浓度的DS/Cu能显著诱导B-ALL细胞（包括Nalm6和原代B-ALL细胞）凋亡，呈剂量依赖性;同时DS/Cu能明显的抑制Nalm6细胞集落形成。 3、DS/Cu可以通过降低B-ALL细胞（包括Nalm6和原代B-ALL细胞）内线粒体膜电位(MMP)水平，下调Bcl-2、Bcl-xl等线粒体凋亡通路相关蛋白的表达，活化Caspase-3、水解PARP等底物蛋白，最终诱导B-ALL细胞凋亡。
急性B淋巴细胞白血病;双硫仑;铜元素;B-淋巴细胞;杀伤作用;分子机制
南方医科大学
硕士
血液病学
郑维扬;徐兵
2015
中文
R733.71;R730.53
69
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）