过表达Hsp75削弱小胶质细胞可溶性因子对神经干细胞毒性作用与机制的研究
目的：阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种以进行性认知功能障碍和记忆损害为特征的神经退行性疾病。其临床表现为记忆力、抽象思维能力和语言功能的减退，情感和行为异常，丧失工作能力和独立生活能力。此外，还有N-甲基-D-门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受体阻断剂等。但是，这些药物只能用来预防及缓解AD的发生及发展，并不能起到根治的作用。因此，寻求新的治疗AD的方法成为了目前关注的焦点。 近年来，干细胞技术不断地完善与提高，给AD的治疗带来了曙光。但是，自从人们提出用神经干细胞技术治疗AD的构想以来，无论是通过促进AD患者内源性神经细胞生成还是通过外源性移植神经干细胞治疗AD都未取得明显的进展，提示AD患者颅内“微环境”的改变可能影响着脑内神经干细胞的生存和功能的发挥。 近年来，线粒体在AD的研究已经成为了一个热点;线粒体不仅为细胞提供能量，也参与了细胞凋亡和坏死的调控。我们的前期研究已经证实，线粒体病变与AD存在着密切的关系，特别是AD颅内环境中的炎性因子加剧了线粒体的损伤。大量研究证明:线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transitionpore，mPTP)在维持线粒体功能、调控细胞的凋亡和坏死中起着重要的作用。mPTP是一个横跨于线粒体内外膜由多种蛋白质组成的非选择性通道，在正常的生理情况下呈关闭的状态或者低通透性的状态，仅分子量不超过1.5kDa的小分子物质才能通过这一孔道;但是在异常的病理情况下，mPTP呈高通透状性态，会引起线粒体的肿胀和外膜的破裂，细胞色素C(cytochrome c，Cytc)等促凋亡物质释放入细胞浆中，激活caspase酶，最终导致细胞的凋亡和坏死，这一过程也称线粒体依赖性凋亡途径。目前，关于mPTP的确切成分存在着许多争议，但是越来越多的研究认为线粒体基质内亲环素D(Clophilin D，CypD)是mPTP的主要成分，也是mPTP形成的启动子;在外界相关刺激因素下，CypD介导了mPTP的形成与开放。 热休克蛋白75(heat shock protein75，Hsp75)也称为肿瘤坏死因子受体相关蛋白1(tumor necrosis factor receptor associated protein1)，其主要定位于线粒体，是一种线粒体蛋白，属于Hsp90家族的成员之一。既往研究已经证实:Hsp75的合成受外界多种环境刺激的影响，包括低糖、缺血缺氧、紫外照射等。此外，Hsp75在维持线粒体功能和调控细胞的死亡也起着至关重要的作用，越来越多的研究表明:Hsp75是一个抗凋亡的蛋白，特别是在心肌细胞及肿瘤细胞中都已证实了其抗凋亡的作用;但是关于Hsp75在阿尔茨海默病中的作用及其机制，在国内外的研究中还尚未报道。 基于上述研究，本课题建立了一个Transwell共培养系统，将神经干细胞和小胶质细胞分别接种于共培养系统的下室和上室以观察两种细胞间非接触性的相互作用。通过构建携带Hsp75基因的腺病毒去感染神经干细胞，使神经干细胞过表达Hsp75蛋白，研究Hsp75蛋白在Aβ刺激小胶质细胞释放可溶性介质对神经干细胞影响中的作用，并进一步从分子水平上去探讨Hsp75蛋白是否通过CypD依赖的mPTP这一通路去调控细胞的功能。本研究成果丰富了AD发病机制的理论基础，也为今后AD的临床治疗提供了技术支持。 方法：1.重组腺病毒Ad-Hsp75-GFP的构建 利用PCR的方法扩增Hsp75基因，凝胶电泳鉴定;pHBAd-MCMV-GFP载体质粒和目的基因Hsp75经酶切、片段回收、连接后，获得重组质粒pHBAd-MCMV-Hsp75-GFP。通过酶切、测序鉴定后，将该重组质粒和骨架质粒共转染HEK293细胞，获得重组腺病毒Ad-Hsp75-GFP，行PCR鉴定和TCID50法进行病毒滴度的测定。 2.神经干细胞C17.2和小胶质细胞BV-2的培养 C17.2神经干细胞培养于10％胎牛血清、5％马血清的DMEM高糖培养基中，于37℃的5％CO2培养箱中培养，每2天换液1次，并于显微镜下观察细胞的生长情况。待细胞生长至占培养瓶底面积约80-90％时，弃去培养基，用PBS缓冲液洗两次，加入1ml的胰酶消化细胞;当细胞在镜下呈收缩渐渐变圆时弃去胰酶，加入含10％FBS的DMEM培养基吹打终止消化。吹打均匀后，用细胞计数板进行计数接种于新的培养瓶，于37℃、5％CO2培养箱中继续培养，取第3-7代的细胞用于后续实验。BV-2细胞的培养方法与C17.2细胞的培养方法类似，只需将培养基换为含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基即可。 3.重组腺病毒感染C17.2神经干细胞及相关检测 将C17.2细胞接种于6孔板（或96孔板），接种密度为2×105个/孔（或1×104个/孔），培养基为含10％胎牛血清、5％马血清的DMEM高糖培养基。置于37℃、5％CO2的孵箱中培养，12h后去除培养基，用PBS漂洗2次，添加感染复数为100的腺病毒液和1ml无血清DMEM高糖培养基，感染2h后弃去含病毒的培养基，用PBS漂洗2次，换2ml含10％胎牛血清、5％马血清的DMEM高糖培养基，于孵箱中继续培养36h后，进行如下相关检测:(1)在荧光显微镜下观察GFP荧光的表达情况。(2)弃去培养基，用PBS漂洗2次，胰酶消化收集细胞，PBS重悬制细胞悬液，用流式细胞仪检测腺病毒在C17.2细胞中的感染率。(3)于倒置相差显微镜下，观察细胞感染前和感染后的形态。(4)对感染前后的神经干细胞进行免疫细胞化学检测，采用神经干细胞特异性抗体nestin进行标记，DAPI对细胞核进行复染，并于荧光显微镜下观察。(5)对感染前后的神经干细胞进行MTT的活性检测，步骤如下:腺病毒感染36h后，弃去培养基，PBS漂洗3次，于每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μl，37℃培养箱中避光孵育4h，弃去上清液，加入150μl的二甲基亚砜(DMSO)，震荡混匀使结晶充分溶解，以酶标仪490nm波长检测OD值。(6)对感染前后的神经干细胞行Western blot检测:用细胞裂解液处理细胞，离心后取上清，BCA法测蛋白质含量，10％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白半干转至PVDF膜上，封闭液封闭后，加入Hsp75多克隆抗体和β-actin小鼠单克隆抗体，之后用辣根过氧化物酶结合的二抗结合，ECL法显色后扫描。 结果：1.重组腺病毒Ad-Hsp75-GFP的成功构建 PCR扩增Hsp75基因后，产物经琼脂糖凝胶电泳分析显示:在约2100bp处可见特异性片段。所获的重组质粒pHBAd-MCMV-Hsp75-GFP经酶切鉴定显示有2100bp和5300bp两条带，与预期结果一致;经测序结果比对后，与目的序列完全匹配。然后，将该重组质粒和骨架质粒共转染HEK293细胞，获得重组腺病毒Ad-Hsp75-GFP，行PCR鉴定可获得与预期大小一致2100bp的片段。采用TCID50方法进行病毒滴度的测定，病毒的滴度可达1×1010 PFU/ml。 2.重组腺病毒成功感染C17.2神经干细胞 重组腺病毒感染C17.2细胞，36h后，置于荧光显微镜下观察，大部分细胞有绿色荧光蛋白的表达;经流式细胞仪检测，腺病毒感染C17.2细胞的感染率约为85％;在倒置相差显微镜下和荧光显微镜下观察到，细胞感染前后其形态无明显的改变，nestin表达也无明显的改变;经MTT检测感染前后细胞的活性，表明感染前后细胞的活性无明显的变化;此外，Western blot检测结果表明:Ad-Hsp75-GFP组与正常组(Control)和腺病毒阴性感染组Ad-GFP相比，Hsp75蛋白表达量明显增加。 3.Hsp75蛋白表达随着小胶质细胞可溶性因子处理时间的延长而增加 实验中我们使用Aβ1-42刺激小胶质细胞释放可溶性因子处理神经干细胞，探讨小胶质细胞释放的可溶性因子对神经干细胞Hsp75蛋白表达水平的影响，Aβ1-42处理时间分别为6h、12h、24h、36h、48h。我们发现:与空白对照组相比，Aβ1-42直接作用组的神经干细胞Hsp75蛋白明显增加，然而共培养对照组并无显著性的差异; Aβ1-42作用的共培养组与空白对照组相比，随着Aβ1-42处理时间的增加Hsp75表达也逐渐增加，均具有显著性意义，但在48h时开始有所下降。基于上述的实验结果选取36h作为后续实验Aβ1-42处理的时间。 结论：1.成功克隆了人的Hsp75基因，并构建了人Hsp75复制缺陷型腺病毒载体(Ad-Hsp75-GFP)，为下一步感染神经干细胞做了准备。 2.重组腺病毒成功感染C17.2神经干细胞，感染效率高且无毒性，证实了腺病毒感染C17.2神经干细胞是一种可行且安全的方法。 3.小胶质细胞可溶性因子诱导神经干细胞Hsp75表达的增多，并且随着处理时间的延长，Hsp75蛋白增加越明显，是神经干细胞的一种内源性保护反应。 4.在小胶质细胞可溶性因子处理神经干细胞的情况下，神经干细胞过表达Hsp75蛋白能够减轻可溶性因子诱导的神经毒性即凋亡率下降、膜电位丢失减少。 5.Hsp75蛋白能够通过减少CypD依赖型mPTP的开放，从而阻断小胶质细胞可溶性因子诱导的线粒体依赖凋亡途径的激活，起到保护神经干细胞的作用。
阿尔茨海默病;神经干细胞;热休克蛋白75;小胶质细胞可溶性因子;毒性作用
南方医科大学
硕士
药理学
王勇
2015
中文
R749.160.2
82
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）