白介素-1β对脓毒症新生幼鼠胼胝体内少突胶质细胞前体细胞分化成熟的影响及机制探讨
新生儿脓毒血症是临床常见的重症疾病，可引起神经系统发育不良，甚至脑瘫。近年来有研究表明感染激发脑内炎症反应是导致脑室周边脑白质损伤（Periventicular White Matter Damage，PWM）的机制之一，脑白质损伤可出现髓鞘完整性的破坏及神经信号传导异常，这可能是神经系统发育不良的机制之一。髓鞘的完整性是神经电信号高效传导的结构基础，其形成过程包括少突胶质细胞的幼稚细胞，即少突前体细胞(Oligodendrcyte Precuror Cells，OPCs)的成熟发育、发育成熟的神经元轴突、两者相互缠绕、粘附。其中OPCs是构成髓鞘的重要细胞，OPCs的发育过程比较复杂，包括(1)O-2A前体细胞时期;(2)O-2A祖细胞时期;(3)少突前体时期;(4)不成熟少突时期;(5)成熟少突时期。有研究表明少突胶质细胞前体细胞较神经元细胞更易损伤，因此机体内环境的变化可能会引起OPCs分化障碍。小胶质细胞是大脑中的免疫细胞，当它暴露于LPS和缺氧的情况下，会迅速释放过多的炎症介质，改变了靶细胞的内环境。这些因子干扰了正常的轴突髓鞘化过程和成熟型OPCs（预OLS）产生。有研究发现缺氧导致的脑内炎症可以引起轴突髓鞘化障碍，可能由于炎症因子及其相应受体相互作用引起，如白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)和IL-1R1(IL-1recptor1)，但炎症因子的具体作用及机制尚不明确。有研究发现体内注射IL-1β可引小鼠的幼鼠少突胶质细胞发育障碍，导致轴突低髓鞘化，但具体机制不明，且是否存在种属差异并不明确。IL-1β在OPCs的发育中起何种作用，IL-1R抑制剂是否有其临床应用价值，需要进一步的研究来探讨。 本研究旨在探讨脓毒症对新生大鼠OPCs发育的影响及IL-1β在其中的作用及机制探讨。因此，进行腹腔注射LPS诱导脓毒症大鼠模型，观察脓毒症大鼠胼胝体内IL-1β的表达及OPCs早期凋亡与增殖以及后期分化及轴突髓鞘化情况，从而证实脓毒症新生大鼠出现OPCs的发育障碍。为了明确IL-1β在OPCs发育中扮演的角色，我们进行OPCs的体外培养，观察IL-1β对OPCs增殖，凋亡及分化的影响，进一步探讨IL-1β影响OPCs分化的可能机制。 第一章 LPS对胼胝体内炎症因子及其受体表达的影响 目的:探讨LPS是否影响胼胝体内炎症因子白介素-1β（Interleukin-1 beta，IL-1β）及其受体IL-1R1(IL-1 receptor1)的表达。 方法:构建脓毒症新生幼鼠模型，使用新生1天的SD乳鼠，实验组腹腔注射1mg/kg的LPS，对照组注射等体积的生理盐水。与母鼠同笼共养至7d，取3h，1d，3d，7d的时间点进行实验，利用免疫荧光及免疫印迹和PCR的方法检测IL-1β和IL-1R1的表达情况。选择0.25mg/mg，0.5mg/kg，1mg/kg，2mg/kg，4mg/kg，8mg/kg6种浓度梯度进行注射，然后进行7天存活率和体重的粗略估计，筛选出成活率最高的0.25mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg，然后根据体重变化及1天，3天IL-1β和IL-1R1的表达情况，确定为1mg/kg最为适宜。 在确定最佳LPS剂量后，验证LPS是否增加炎症因子IL-1β及其受体IL-1R1的表达，分为生理盐水对照组及LPS组，取3h，1d，3d，7d几个时间点，在进行相应处理后利用免疫荧光，免疫印迹及PCR的方法检测脑胼胝体内IL-1β及IL-1R1的表达及定位情况。 结果:等待孕鼠生产，生仔约8-15只不等，将新生1d的SD乳鼠，体重约5-7g，分别注射LPS及生理盐水，对照组处理1d后体重约7-9g，3d后约12-13g，7d后约18-20g，0.25mg/kg的LPS注射1d后体重为8-9g，3天后为12-13g，7d后为18-20g，与对照组无差别，弃去此剂量。0.5mg/kg LPS注射1d后体重为7-9g，3天后为11-13g，7d后为16-19g，与对照组差别不大，弃去此剂量。 根据上述筛选结果，后续免疫荧光、免疫蛋白印迹、PCR实验发现1mg/kgLPS处理3h，1d，3d，7d后的胼胝体内炎症因子IL-1β及其受体IL-1R1表达较对照组明显增加(P＜0.05)。 结论:LPS可引起胼胝体内小胶质细胞的激活并释放大量炎症介质IL-1β，在少突胶质前体细胞(OPCs)上存在IL-1R1及受体表达增加。 第二章 脓毒症模型对OPCs凋亡及增殖分化的影响 目的:探讨1 mg/kg LPS注射后对OPCs凋亡和增殖及分化的影响。 方法:利用双标免疫荧光的方法探讨脓毒症模型对OPCs凋亡及增殖的影响。将新生1d的SD乳鼠处理后，分为对照组及LPS组，与母鼠同笼共养至28d，取1d，3d，7d，14d，28d的胼胝体进行观察。检测Cleaved-Caspase-3（细胞凋亡标记物）和BrdU(细胞增殖标记物)的表达。利用双标免疫荧光、WB及PCR的方法探讨脓毒症模型对OPCs分化的影响。将新生1d的SD乳鼠处理后，分为对照组及LPS组，与母鼠同笼共养至28d，取7d，14d，28d的胼胝体进行观察。检测幼稚少突胶质细胞标志物PDGFRα和NG2的的表达情况，检测成熟少突胶质细胞标志物MBP及CNPase的表达情况。检测OPCs特异性因子Olig1以及Olig2的表达情况。 结果:与对照组相比，OPCs在1d，3d，7d时凋亡细胞数增多而增殖细胞数降低，免疫荧光实验及免疫蛋白印迹实验表明PDGFRα和NG2在7d时较对照组减少，14d及28d时较对照组增多，而MBP及CNPase表达较对照组降低，7d，14d，28d胼胝体内Olig1和Olig2表达量较对照组降低。 结论:LPS所诱导的脓毒症模型促进了早期OPCs的凋亡，抑制了早期OPCs的增殖及分化。 第三章 脓毒症模型对胼胝体内轴突髓鞘化的影响 目的:探讨脓毒症模型对胼胝体内轴突髓鞘化的影响。 方法:使用透射电镜进行探究。将新生1d的SD乳鼠处理后，分为对照组及LPS组，与母鼠同笼共养至28d，取28d的胼胝体进行电镜观察。检测胼胝体内有髓神经纤维的数目及髓鞘的厚度。 结果:与对照组相比，28d时LPS组胼胝体内有髓神经纤维的数目及髓鞘的厚度均降低（*P＜0.05）。 结论:LPS诱导的脓毒症模型可以导致轴突低髓鞘化。 第四章 IL-1β对OPCs凋亡与增殖及分化的影响 目的:探讨IL-1β对OPCs凋亡及增殖及分化的影响。 方法:取新生1天SD乳鼠的脑皮层进行混合细胞培育，使用少突前体增殖培育基，增殖培育7天，然后分组后增殖1天，分为对照组（PBS组）、30ng/ml IL-1β组、30ng/ml IL-1β+30ng/ml IL-1Ra组（IL-1Ra，IL-1R的特异性拮抗剂）。进行免疫荧光检测凋亡及增殖情况。 结果:三组凋亡无差别。IL-1β组增殖的OPCs数较对照组及IL-1β+IL-1Ra组减少。免疫荧光显示与对照组相比，处理3d后IL-1β组幼稚的OPCs细胞数增多(NG2标记)。与IL-1β组相比，IL-1β+IL-1Ra组幼稚的OPCs细胞数有所减少。与对照组相比，IL-1β组成熟的OPCs减少（MBP标记）。与IL-1β组相比，IL-1β+IL-1Ra组成熟的OPCs较前增多。 结论:IL-1β可抑制OPCs增殖及分化，但未对OPCs凋亡过程产生影响。 第五章 IL-1β对FYN-MEK-ERK通路的影响及两者调控OPCs分化的关系 目的:探讨IL-1β对FYN-MEK-ERK通路的影响及两者调控OPCs分化的关系。 方法:(1)取新生1天SD乳鼠的脑皮层进行混合细胞培育，使用少突前体增殖培育基，增殖培育7天，增殖后，消化后种相同细胞数，使用少突胶质细胞分化培养基进行分化培养6h，各组处理6h后用WB法观察磷酸化FYN，磷酸化MEK，磷酸化ERK表达。分为对照组（PBS组）、30ng/ml IL-1β组、30ng/mlIL-1β+30ng/ml IL-1Ra（IL-1Ra，IL-1R的特异性拮抗剂）。(2)构建ERK质粒，进行质粒转染，分为对照组（PBS组）、30ng/ml IL-1β组、ERK目的基因组、30ng/ml IL-1β+ERK目的基因组、空载体pEGFP组。此5组进行分化3d后进行免疫蛋白印迹检测(Western blotting，WB)观察NG2、PDGFRα、Olig1、Olig2、MBP、CNPase表达情况。 结果:(1)与对照组相比，处理6h后IL-1β组磷酸化-FYN，磷酸化-MEK，磷酸化-ERK的表达有所降低。(2)与IL-1β组相比，IL-1β+IL-1Ra组磷酸化-FYN，磷酸化-MEK，磷酸化-ERK的表达有所回升。(3)与IL-1β组相比，IL-1β+ERK基因组幼稚标志物NG2、PDGFRα降低，成熟标志物MBP、CNPase、Olig1、Olig2表达升高。 结论:IL-1β可能通过抑制ERK通道来调控OPCs的分化。
新生儿脓毒血症;白介素--1β;少突胶质细胞;发育障碍
南方医科大学
硕士
急诊医学
陈纯波;邓医宇
2015
中文
R631
80
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）