高迁移率族蛋白B1与晚期糖基化终产物受体对前列腺癌PC-3细胞生物学行为的影响
前列腺癌是欧美国家男性发病率最高的恶性肿瘤，在美国其死亡率仅次于肺癌居第二位。据美国癌症协会估计，美国2015年前列腺癌发病患者将达到220800人，占男性所有恶性肿瘤的26％，其死亡人数较前虽有轻微下降，但仍将达到27540人。我国前列腺癌的发病率虽低于西方国家，但由于生活方式西化、人口老龄化及前列腺特异抗原(PSA)筛查的普及，近10年来前列腺癌的发病率和死亡率均呈明显上升趋势，且增长比欧美发达国家更为迅速。 由于前列腺癌早期发病隐匿，患者确诊时不少已有远处转移，因而失去了根治性治疗的最佳时机。随着直肠指诊（DRE）联合PSA应用筛查的普及，前列腺癌早期诊断率有了显著的提高。但是PSA的敏感性和特异性皆存在一定的局限性，致使其在临床应用上仍存在一些争议。当以血清PSA＞10ng/ml为参考值时，临床漏诊率为25％;当PSA值位于临床诊断灰区的4～10ng/ml时，仅有30％的患者被诊断为前列腺癌。治疗上，根治性治疗（根治性前列腺切除术、外放射治疗）是目前局限性前列腺癌最有效的治疗方法，但部分根治性治疗的早期前列腺癌患者仍有复发的可能。转移性前列腺癌的治疗目前主要依靠内分泌治疗，但是往往因逐渐对激素非依赖而发展为去势抵抗性前列腺癌（CRPC），使治疗变得更加困难。由此，当前需要迫切寻找新的特异性和敏感性均较高的前列腺癌标志物以及潜在的治疗新靶点，尽可能做到早发现、早诊断、早干预、早治疗，并且进一步提高疗效，这是当前前列腺癌研究的重要课题。 但前列腺癌发生发和进展的分子机制至今仍不清楚。以往的研究表明，前列腺癌的发生发展与染色体畸形、野生型p53、p16、PTEN、mn23、NKX3.1、Rb等抑癌基因的失活，c-myc、c-met、ras等癌基因的异常表达，AR、PSA、VDR等基因多态性及TMPRSS2-ERG基因融合等过程有关。而近年的研究表明，高迁移率族蛋白B1（HMGB1）及其主要受体晚期糖基化终产物受体(RAGE)也与前列腺癌的发生发展密切相关。 HMGB1是高迁移率族蛋白B（HMGB）家族成员，因在聚丙烯酰胺凝胶电泳时的快速迁移而得名。HMGB1早期命名为两性素（amphoterin），是一种存在于真核生物细胞内的非组蛋白染色体结合蛋白。细胞核内的HMGB1参与稳定核小体结构、DNA重组和修复、调节基因转录及类固醇激素调控等生命活动。胞内HMGB1还可以由炎症细胞主动分泌或者坏死细胞被动分泌进入胞外。胞外的HMGB1同时是损伤相关分子模式（DAMP）分子，参与许多肿瘤相关炎症的发生。它能作为一种信号分子，由细胞核内的分泌到细胞外，在免疫、炎症、自噬、细胞分化、细胞迁移及肿瘤增殖转移等病理生理过程中发挥重要作用。胞外HMGB1的受体包括RAGE、Toll样受体家族(Toll-like receptor，TLR)、CD24、IL-1R、髓系细胞触发受体1(TREM-1)等。细胞外的HMGB1可以通过与其受体结合，主要是通过与RAGE结合，广泛地参与了肿瘤的发生、生长、浸润及转移等过程。 RAGE最早是Neeper等从牛肺中获得的。它是一种单跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族跨膜受体。人RAGE编码基因位于Ⅲ类主要组织相容性复合物（MHCⅢ）区域。人RAGE由404个氨基酸组成，位于细胞膜上，由胞外段、跨膜段和胞内段组成。RAGE在人体生理情况下呈低水平表达（除成熟Ⅰ型肺泡细胞和胚胎细胞外），而在糖尿病、自身免疫病、神经变性疾病、血管疾病及肿瘤等疾病中表达显著增高。RAGE作为信号转导受体介导其配体结合在单核巨噬细胞、血管内皮细胞、肾系膜细胞、神经细胞、血管平滑肌细胞及多种肿瘤细胞表面，激活细胞内部各种信号转导机制，发生病理效应。RAGE虽然是由于与晚期糖基化终产物(AGE)相互作用被发现并因此得名，但其配体除AGE之外，还包括HMGB1，β-淀粉样多肽（amyloid-β peptide），S100蛋白等，这些配体分别与RAGE相互作用，激活相应的信号转导途径，产生不同的生物学效应，在各种疾病中扮演着不同的角色。 近些年来，HMGB1与RAGE对肿瘤的作用越来越受到人们的关注。目前已发现HMGB1/RAGE轴与包括结直肠癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、口腔鳞状细胞癌、恶性间皮瘤等恶性肿瘤密切相关。研究认为，HMGB1及其受体RAGE可调控这些肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，而阻断RAGE与其配体HMGB1的相互作用，能够抑制肿瘤的生长及转移。HMGB1/RAGE轴与前列腺癌的作用关系是近年才被发现的。2003年，Kuniyasu等对40名术前经促性腺激素释放激素(LHRH)抑制剂去势治疗的pT3期前列腺癌患者的术后标本进行检测，发现肿瘤细胞及间质细胞中的RAGE和HMGB1呈高表达，在有转移的患者中更明显;进一步的细胞学实验还发现在阻断雄激素后，HMGB1/RAGE系统可通过旁分泌途径促进肿瘤细胞与间质细胞的相互作用，从而促进前列腺癌的发展和转移。2005年Ishiguro等研究发现HMGB1和RAGE在未经治疗的前列腺癌组织和激素难治性前列腺癌组织中的mRNA水平表达较正常前列腺组织明显增高。在3种前列腺癌细胞株(DU145，PC-3和LNCaP细胞)中，发现在DU145即激素非依赖性前列腺癌细胞株中，RAGE表达最高。HMGB1在上述3个细胞株中均有表达。2012年Elangovan等通过体外动物实验和体内细胞实验发现通过特异性阻断HMGB1/RAGE轴能抑制前列腺肿瘤生长。 在我们前期的工作中，我们通过免疫组化证实在组织水平，HMGB1和RAGE在前列腺癌组织中存在高表达，HMGB1和RAGE蛋白的表达以及两者的共表达与前列腺癌的浸润深度、局部淋巴结的转移以及远处转移密切相关，进一步对随访资料进行Kaplan-Meier生存分析后发现， HMGB1和RAGE的共表达与晚期前列腺癌患者的预后呈负相关关系。 目的： HMGB1和RAGE在前列腺癌中是否存在相互作用，及其相互作用对前列腺癌生物学行为（增殖、迁移、凋亡等）有何影响及可能存在的作用机制。在细胞水平进一步探索及验证。这将为HMGB1和RAGE对前列腺癌诊断、治疗和评估的意义提供实验依据，为前列腺癌的临床诊治提供新的思路和方法。 方法： 基于以上认识，本研究首先进行用Western Blot检测3种前列腺癌细胞系及前列腺增生细胞系中HMGB1蛋白的表达情况;利用免疫荧光技术观察HMGB1在前列腺癌细胞系和前列腺增生细胞系的定位情况;利用琼脂糖亲和柱(Ni-IDA)纯化获得外源性HMGB1蛋白;接着利用CCK-8检测外源性HMGB1刺激下前列腺癌PC-3细胞的增殖情况;然后用细胞划痕实验观察外源性HMGB1刺激下前列腺癌PC-3细胞的迁移情况;再利用Annexin-V-FITC凋亡试剂盒检测外源性HMGB1对PC-3凋亡能力的影响。利用免疫荧光观察HMGB1质粒的转染效率，进一步用Western Blot验证HMGB1过表达模型;接着分别利用CCK-8检测、细胞划痕实验、凋亡试剂盒检测过表达HMGB1下对前列腺癌PC-3细胞的增殖、迁移情况、凋亡能力的影响。利用RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术干扰前列腺癌PC-3细胞RAGE的表达;在沉默RAGE情况下，分别用CCK-8检测、细胞划痕实验、凋亡试剂盒检测外源性HMGB1对PC-3增殖、迁移和凋亡能力的影响，以观察HMGB1与RAGE在前列腺癌细胞中的相互作用。 结果： 1.前列腺癌细胞高表达HMGB1;HMGB1在前列腺增生细胞系和前列腺癌细胞系主要表达于细胞核内，在细胞质中也有表达。 2.成功纯化得到His-HMGB1融合蛋白。 3.外源性HMGB1呈浓度依赖性及时间依赖性促进前列腺癌PC-3细胞增殖;外源性HMGB1刺激前列腺癌细胞可促进其迁移能力;外源性HMGB1刺激前列腺癌细胞可促进其抗凋亡能力。 4.观察HMGB1质粒在前列腺癌PC-3细胞的转染效率，并成功构建过表达HMGB1的前列腺癌细胞模型。 5.过表达HMGB1蛋白可促进前列腺癌PC-3细胞增殖、迁移和抗凋亡能力。 6.利用RNAi技术成功沉默前列腺癌PC-3细胞RAGE蛋白的表达。 7.沉默RAGE后，HMGB1促进前列腺癌PC-3细胞增殖、迁移和抗凋亡的能力下降。 结论： 本课题通过外源性刺激和细胞内过表达两种方式，研究了HMGB1及其受体RAGE对前列腺癌细胞生物学行为的影响。结果显示HMGB1可通过RAGE促进前列腺癌细胞增殖、迁移及抗凋亡能力。这不但加深了我们对HMGB1与RAGE蛋白生物学功能的认识，而且还为前列腺癌的诊断、治疗和评估提供新的理论和实验依据，为前列腺癌的临床诊治提供新的思路和方法。
前列腺癌;晚期糖基化终产物受体;高迁移率族蛋白B1;肿瘤细胞;生物学行为
南方医科大学
硕士
泌尿外科
赵善超
2015
中文
R737.25
70
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）