血浆microRNA-29c在单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化模型中的表达及意义
研究背景: 慢性肾脏病(Chronic kidney disease，CKD)是许多病因导致的进行性疾病，发病的早期大多数无临床症状，由于肾脏的储备功能，早期血肌酐常维持在正常范围内，一旦出现临床症状或血肌酐明显升高，疾病往往是发展到中晚期阶段。在慢性肾脏病发病的早期予以诊断并给予治疗，延长肾脏寿命，推迟或避免行肾脏替代治疗，是提高患者生活质量、延长生命、减少肾脏替代治疗并发症的关键，同时也是减轻家庭和社会负担的重要举措。 肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis，RIF）是进行性肾脏病发生和发展过程中肾脏组织发生的主要病理改变，是许多病因导致肾功能衰竭的共同途径。研究证实，转化生长因子-β(transforming growth factorbeta，TGF-β)/Samds信号通路通过调控miRNA参与RIF的发生。 研究目的: 本研究通过检测建模后3、7天末假手术(sham operation，Sham)组和单侧输尿管梗阻(unilateral urethral obstruction，UUO)组血浆及术侧肾脏组织中microRNA-29c(miR-29c)、术侧肾脏组织RIF程度、纤维化相关指标:E-钙蛋白(E-cadherin)、胶原蛋白-Ⅰ(collagen protein-Ⅰ，Col-Ⅰ)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、TGF-β1、Smad3蛋白的表达水平。分析miR-29c与RIF程度、E-cadherin、Col-Ⅰ、α-SMA、TGF-β1、Smad3蛋白之间的关系。探讨miR-29c作为诊断RIF特异性循环学诊断标志物的可能性;拟进一步阐明RIF的病理机制，为临床防治RIF提供相应的理论和新的治疗靶点。 研究方法: 1.UUO模型的建立:20只SD雄性大鼠随机分为2组，即Sham组和UUO组，各组10只。3％戊巴比妥钠溶液按0.5ml/100g腹腔注射麻醉，取左侧腹肾区约2-3cm切口进入腹腔，找到左侧髂血脉，根据输尿管跨过髂血管的解剖标志，找到左侧输尿管并游离至肾盂处，UUO组分别于近左肾盂处和输尿管上1/3水平处使用0号丝线结扎，Sham组仅游离左侧输尿管不结扎，逐层缝合腹壁，术后将2组大鼠放置于清洁干燥环境中，自由进食水，两组大鼠均在同等条件下饲养。 2.大鼠血液及术侧肾脏组织标本获取:术后第3、7天末，分别从2组大鼠中随机抽取5只大鼠，3％戊巴比妥钠溶液按0.5ml/100g腹腔注射麻醉，麻醉满意后，以组织剪于腹壁正中纵行剪开腹腔和胸腔，游离出心脏，采血针从心尖部位插入左心室，取血2-3ml置于EDTA抗凝管中，1200r/min离心后分离出血浆，置于-80℃冰箱保存备用，取血完毕后立即将灌注针于采血针部位插入至主动脉弓，使用冰盐水行心脏灌注，直至双侧肾脏变苍白，然后取出术侧肾脏，获取约2mm厚肾脏组织，分别置于4％多聚甲醛液和RNAlater保存液中，放在-80℃冰箱中保存备用。 3.大鼠术侧肾脏组织病理检查 3.1 Masson、HE染色:对术后3天末和7天末Sham组和UUO组经4％多聚甲醛固定的肾脏组织行Masson、HE染色，HE染色观察各时间点大鼠肾脏组织结构的改变，判断建模是否成功;Masson染色主要评估RIF程度，计数算肾间质纤维化指数(％)，依据肾间质纤维化指数进行分级，按Banff07RIF评分标准对肾脏组织纤维化程度进行半定量评分:每个标本在光镜下随机选取10个不重复的肾皮质区(×200)，进行拍照，采用IPP6.0(Image-Pro Plus6.0)图像分析软件计算每个视野纤维化面积占该视野的百分比，根据如下标准计算每个视野纤维化分值:无损伤，间质纤维化少于皮质区5％，0分;轻度损伤，间质纤维化占皮质区的6％-25％，1分;中度损伤，间质纤维化占皮质区26％-50％，2分;重度损伤，间质纤维化大于皮质区50％，3分，把10个视野分值求和后取平均值，得到该切片的纤维化分值。 3.2 肾脏组织免疫组化:采用EliVision法，即3μm石蜡切片脱蜡至水，枸橼酸缓冲液沸水煮20min修复抗原，3％过氧化氢灭活内源性酶，分别加入兔抗人Col-Ⅰ单克隆抗体（1∶200稀释）、兔抗人E-cadherin单克隆抗体（1∶200稀释）、兔抗入α-SMA单克隆抗体（1;200稀释）、兔抗人TGF-β1多克隆抗体(1∶200稀释)、兔抗人Smad3多克隆抗体（1;200稀释）后4℃孵育过夜，滴加聚合物增强剂后滴加酶标抗鼠/兔聚合物，DAB显色，显微镜下控制显色反应;苏木素复染，中性树胶封片。采用IPP6.0图像分析软件，每个标本随机选取10个不重复视野(×200)，所有抗体阳性表达部位呈黄色，计算每个视野中阳性面积所占视野的百分比。 4.血浆及肾脏组织miR-29c表达的测定:经匀浆、两相分离、RNA沉淀、RNA清洗、重新溶解RNA沉淀步骤提取血浆及肾脏组织中的样品RNA;以RNA为模板、RT混合液为反应液、使用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)扩增仪进行RT反应，逆转录合成cDNA。将所有cDNA样品分别配置qRT-PCR反应体系。体系配置如下:2×Master Mix5μl，10uM的PCR特异引物F0.5μl，10uM的PCR特异引物R0.5μl,加水至总体积为8μl，将溶液混合，5000r/min短暂离心。将8ul混合液加到384-PCR板对应的每个孔中，再加入对应的2μlcDNA，粘上Sealing Film封口膜，并短暂离心混合。将上述384-PCR板置于qRT-PCR仪上进行PCR扩增反应，反应结束后对PCR产物进行溶解曲线分析，以U6为内参，3天对照组为基准，结果采用2-△△CT表示。 5.统计学分析:采用SPSS13.0软件系统分析。所有计量数据均以x±s表示，两组间比较采用完全随机设计t检验，相关性分析采用spearman相关系数进行分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。 研究结果: 1.Sham组，术后3天和7天末术侧肾脏与对侧肾脏比较无明显变化:肾脏无增大、无积水;UUO组，术后3天和7天末术侧肾脏较对侧明显增大，有明显肾积水，术后7天末相对术后3天末肾脏增大和肾积水更加明显; 2.观察HE染色切片:Sham组术后3天、7天末肾单位大小、形态均未见异常，UUO组术后3天末见肾小管轻度扩张、小管上皮空泡样变，间质轻度水肿并散在炎性细胞，术后7天末即可观察到明显的肾间质增宽、胶原沉积增加、肾小管萎缩、炎症细胞浸润明显; 3.观察Masson染色切片，Sham组术后3天和7天末Masson染色无变化，肾单位及间质未见异常。UUO组术后3天末，可见肾小管管腔轻度扩张，部分间质可见少量淡蓝色胶原组织沉积，UUO组术后7天末，肾小管较3天末明显扩张，间质水肿增宽明显伴单核细胞及淋巴细胞广泛浸润，间质胶原纤维进行性增多、面积扩大、蓝染加重; 4.两组术后同时间点比较，UUO组RIF半定量评分显著高于Sham组(P＜0.01)，血浆及肾脏组织中miR-29c和组织中E-cadherin的表达量显著低于Sham组(P＜0.01)，组织中Col-Ⅰ、α-SMA、TGF-β1及Smad3蛋白的表达量显著高于Sham组(P＜0.01); 5.UUO组术后7天末与3天末比较，RIF半定量评分显著增加(P＜0.01)，血浆和肾脏组织miR-29c以及组织E-cadherin表达量均是显著降低(P＜0.01)，组织中Col-Ⅰ、α-SMA、TGF-β1及Smad3蛋白表达量显著升高(P＜0.01)，Sham组以上指标均无变化; 6.相关性分析:UUO组血浆和组织中miR-29c表达量一致性下降，与组织中E-cadherin表达量的下降呈正相关(r=0.633、0.672，P＜0.01)，与RIF程度呈负相关(r=-0.581、-0.712，P＜0.01)，与组织Col-Ⅰ、α-SMA、TGF-β1及Smad3蛋白表达量的升高呈负相关(r=-0.812、-0.779;-0.774、-0.781;-0.741、-0.682;-0.695、-0.594; P＜0.01)。 研究结论: 1.从术侧肾脏外观、肾脏组织HE、Masson染色、免疫组化观察证明建模成功; 2.术后7天末和3天末比较，Sham组肾间质无明显纤维化，血浆及肾脏组织miR-29c无明显改变;UUO组RIF明显增加，miR-29c明显降低，并与组织E-cadherin的降低呈正相关，与组织Col-Ⅰ、α-SMA、TGF-β1及Smad3蛋白的升高呈负相关，由此推断血浆中miR-29c可能是通过TGF-β1/Smad3信号传导通路的调节参与RIF的发生和发展，有望成为RIF无创性血液学诊断标志; 3.TGF-β1/Smad3信号传导通路可能是通过下调miRNA-29c参与RIF，为临床防治RIF提供理论基础和新的治疗靶点。
肾间质纤维化;病理机制;非编码核糖核酸;蛋白表达
南方医科大学
硕士
泌尿外科（肾移植）
郭颖
2015
中文
R692;R363.2
76
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）