红背叶根醇提物的药效学及化学成分的初步研究
背景: 肝纤维化（Hepatic fibrosis）是指肝细胞发生坏死及炎症刺激时，肝脏中胶原蛋白等细胞外基质(ECM)的增生与降解失去平衡，进而导致肝脏内纤维结缔组织异常沉积的病理过程。 红背叶根为大戟科植物红背山麻杆Alchornea trewioides(Benth.) Muell.-Arg.的根。分布于我国中部和东南、华南，通常以根、叶入药。其根味甘，性平。功效清热解毒，祛风除湿，散瘀止血，平喘，杀虫止痒。近代医学研究表明，红背叶根中含大量生物碱和酚性物质，具有止咳、祛痰作用，抗乙酰胆碱作用和轻度抑制金黄色与白色葡萄球菌作用。 本课题组前期研究发现其水提物及水提醇沉提取的浸膏具有抗肝炎病毒和抗肝纤维化的作用，可在临床上用以治疗慢性肝炎和肝硬化。课题组的研究结果表明红背叶根可显著抑制CCL4复合因素及酒精性肝纤维化大鼠血清中TGF-β1和TIMP-1，且能显著降低血清中HA、PCⅢ、ALT、AST水平。临床应用试验表明慢性乙型肝炎患者给予红背叶根20克，水煎服，每日一次。治疗4周后，患者临床症状均有一定的改善，尤其是缓解肝区不适感较明显，患者肝功能均有不同程度改善;治疗12周后，治疗组与对照组比较，AST和改善蛋白代谢方面较为明显（P＜0.05）。课题组研究了红背叶根对卡介苗和脂多糖诱导的小鼠免疫性肝损伤的保护作用，结果表明红背叶根可显著改善免疫性肝损伤小鼠的胸腺、肝脏、脾脏系数，降低血清中ALT、AST、NO的活性以及肝组织匀浆中TNF-α、IL-1β的含量，提示红背叶根对免疫性肝损伤具有显著的保护作用。红背叶根能显著降低肝纤维化大鼠全血黏度150/s切变率、30/s切变率、5/s切变率、1/s切变率、红细胞压积、HA、LN、PCⅢ、CⅣ、ALT和AST，改善纤维化大鼠舌下及耳廓络脉的循环状态，从而提示“活血通络”可能是其抗纤维化的主要病机之一。更进一步研究红背叶根水提物、醇提物和红背叶根总生物碱对CCL4致小鼠肝损伤的作用机制发现:红背叶根水提物、醇提物和总生物碱均能明显降低模型小鼠血清中ALT、AST及总胆红素水平，减轻肝细胞变性、炎细胞浸润及坏死等病变，但其保肝机制及总生物碱的分离纯化有待进一步研究。本课题组前期研究了红背叶根3个有效部位，分别是石油醚有效部位，乙酸乙酯有效部位，正丁醇有效部位对Con-A诱导的小鼠急性肝损伤，可降低小鼠血清ALT、AST、TNF-α、INF-γ及肝组织MDA含量，提高肝组织SOD活力，并可改善肝脏的组织形态，其乙酸乙酯及正丁醇有效部位有体外抑制HBsAg和HBeAg作用。红背叶根乙酸乙酯有效部位体外实验还表明乙酸乙酯有效部位可以抑制HCV的复制，为抗HCV RNA表达的活性部位。并且在预实验中，我们通过对红背叶根醇提物、正丁醇萃取物、乙酸乙酯萃取物和石油醚萃取物对肝纤维化大鼠的作用比较得出，三种有机溶剂对肝纤维化作用均不如总醇提物效果好。这提示我们红背叶根抑制肝纤维化的作用是多种成分共同作用的结果。 综合文献参考及课题组前期研究成果，对红背叶根中药材进行提取和分离有效部位和有效单体进行深入研究，探知其保肝作用的有效成分并探讨其起效的机制。具体实验方法拟通过体内和体外实验两部分进行。 方法: 1.红背叶根醇提物的制备工艺及质量控制 本课题组根据前期实验分析的核磁共振氢谱(H-NMR)和碳谱(13C-NMR)，结合HPLC等方法分析，结果显示本课题组从红背叶根中所分离的单体化合物主要为为酚酸类物质与皂苷类物质。本实验研究建立了紫外分光光度法分别测定红背叶根中药材中总酚酸、总皂苷、总黄酮的含量。并采用RP-HPLC法建立了单一有效成分没食子酸的质量控制方法学，并检测了红背叶根中丁香酸、β-谷甾醇、羽扇豆醇及没食子酸乙酯等单体化合物的含量，初步探索了红背叶根药材的物质基础。还筛选了指纹图谱研究的最优系统洗脱条件。 2.动物实验 2.1 实验动物分组动物实验分为两部分。实验一为红背叶根活性成分筛选实验。动物分组（共13组）为:空白对照组（以下简称空白组），红背叶根乙醇提取物高、中、低剂量组，正丁醇提取物高、中、低剂量组，乙酸乙酯提取物高、中、低剂量组，石油醚提取物高、中、低剂量组。实验二为红背叶根乙醇提取物抗肝纤维化的机制研究。动物分组为:空白对照组（以下简称空白组）、模型组、秋水仙碱对照组及红背叶根醇提物(AE)组。 2.2 动物模型的制备与给药选用SPF级雄性SD大鼠，除去空白对照组外，其余各组按2mL/kg体重，腹腔注射40％CCL4花生油溶液(2∶3，v/v)，每周2次。正常饮食饮水，每周日称体重并记录，连续8周。正常组与模型组用生理盐水灌胃，干预组组分别给予相应药液灌胃，灌胃体积为2mL/只。 2.3 实验动物样品制备各组大鼠模型完成后，用10％水合氯醛麻醉大鼠(0.3ml/100g)，经腹主动脉采血，4℃低温静置6小时后，3000rpm离心15分钟，分离上层血清，-80℃保存备用，用于检测血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶（ALT/AST）、透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、三型前胶原(PCⅢ)、四型胶原(CⅣ)，以及转化生长因子beta1(TGF-β1)水平、基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)水平;然后取出大鼠肝脏，观察其大体形态，称肝脏湿重计算肝脏指数。并于肝左叶中部取新鲜肝脏组织后立即用10％中性福尔马林固定后进行病理切片处理（石蜡切片），HE染色及Masson染色，继而进行各种免疫组化检测(IHC)，观察肝脏组织病理学变化，同时检测肝组织中alpha-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及凋亡相关蛋白(Cleaved Caspase3)的表达情况;同时取相同部位的肝脏做肝组织匀浆，用于免疫印迹实验(Westem Blot analysis)，检测肝组织中相关蛋白的表达改变。 3.体外细胞实验 3.1 细胞毒性测试将正常肝细胞(LO2)和人源性肝星状细胞(hHSC)分别接种于96孔板，用不同浓度的含红背叶根醇提物(AE)培养基(0.0，0.3125，0.625，1.25，2.5，5.0，10.0，20.0μg/ml)培养24小时，加MTT液孵育4小时，去上清后加DMSO溶解甲鑚颗粒，测OD值，计算细胞半数抑制率，确定红背叶根对正常细胞的毒性范围以及对HSC的最佳药物浓度。 3.2 活化hHSC模型实验用TGF-β1细胞因子诱导人源性肝星状细胞(hHSC)活化，再用含不同浓度红背叶根AE培养基孵育24小时后，收集上清液做其他检测，收集细胞爬片做免疫组化染色，收集细胞提取蛋白做Western blot。 4.统计方法 采用SPSS13.0以及Graph Pad Prism5.0软件统计分析并作图，实验结果通过均值±标准差表示。根据实验的设计不同采用不同的统计方法:各组间均数比较采用one-way ANOVA，方差齐性时采用LSD法进行组间多重比较，方差不齐时采用Welch法，组间多重比较采用Dunnett's T3法;重复测量数据采用repeated measures分析统计，满足球形检验时采用Sphericity Assumed，不满足球形检验时采用Greenhouse-Geisser校正系数;相关性分析采用Spearman'srank correlation test。P＜0.05为有统计学差异。 结果: 1.以没食子酸为对照品做紫外分光光度法测得红背叶根中药材中总酚酸含量高达16.7％，以人参皂苷为对照品测得总皂苷含量达11.7％，以芦丁为对照品测得总黄酮含量是15.2％。并用反相高效液相色谱法检测了红背叶根中的没食子酸(0.98％)、丁香酸(0.92％)、β-谷甾醇(0.78％)，没食子酸乙酯和羽扇豆醇因含量较低峰值过小测定值不稳定。并且以没食子酸为对照品对红背叶根建立质量控制标准及方法学研究包括:精密度试验(RSD=0.71％)、稳定性试验(RSD=1.35％)、重现性试验(RSD=0.8％)和准确度试验(RSD=1.23％)。并探索了建立红背叶根的HPLC指纹图谱的实验条件:乙醇可以作为溶解红背叶根药材的溶剂;加热回流方法比超声提取方法得到的HPLC图形分离度和饱和度更优，故以加热回流提取法为提取方法;HPLC图谱的最大吸收波长为228nm、273nm;流动相为乙腈(A)-0.1％磷酸溶液(B)。 2.高剂量与中剂量的红背叶根乙醇提取物有保护肝细胞、降低血清转氨酶和抑制肝脏中胶原沉积的作用，并且该作用比正丁醇、乙酸乙酯、石油醚提取物的作用显著。低剂量正丁醇提取物也有改善转氨酶的作用，但对抑制胶原沉积作用不明显。根据实验结果，红背叶根醇提物的有效剂量至少是0.2 g/ml。 3.红背叶根醇提物对正常肝细胞的毒性很小。 4.CCL4腹腔注射造肝纤维化动物模型的实验方法是可靠的。 5.红背叶根可以抑制肝纤维化的慢性进展过程。 6.红背叶根可以减轻肝细胞凋亡和肝损伤。 7.红背叶根可以抑制α-SMA在肝脏中的表达和血清TGF-β1水平。 8.红背叶根可以抑制肝脏中TIMP-1的表达，促进MMP-3的释放。 结论: 红背叶根乙醇提取物具有保肝降酶，抑制肝纤维化的作用，其机制可能是通过抑制正常肝细胞凋亡，并抑制肝星状细胞的活化增殖和促进其凋亡，从而减少细胞外基质的合成和促进细胞外基质的分解。并且红背叶根醇提物中含有酚酸、皂苷和黄酮类物质。
肝纤维化;红背叶根;乙醇提取物;药理活性;化学成分
南方医科大学
博士
中西医结合临床
吕志平
2015
中文
R256.4;R285
108
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）