牛白细胞介素-2和牛分枝杆菌Ag85A单克隆抗体的制备与鉴定
牛结核病(Bovine tuberculosis，bTB)主要是由牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis，M.bovis）等引起的一种重要的人兽共患传染病。牛感染牛分枝杆菌后，主要诱导机体产生Th1型细胞免疫应答反应，其中白细胞介素-2是Th1型细胞免疫应答产生的主要细胞因子之一。牛白细胞介素-2(BoIL-2)是由特异性抗原或丝裂原刺激后，机体分泌的一种具有多种生物学活性的细胞因子，在机体免疫系统中发挥重要的调节作用。Ag85复合物是结核分枝杆菌一种主要的分泌蛋白，主要由三种分泌蛋白Ag85A、Ag85B和Ag85C组成。研究表明Ag85A可刺激机体产生Th1型细胞免疫应答，诱导IFN-γ、TNF-α和IL-2等细胞因子的分泌，是一种重要的免疫优势抗原。因此，本研究分别制备牛IL-2和牛分枝杆菌Ag85A的单克隆抗体，为牛结核病的预防与诊断等研究提供重要的生物材料。 1.牛IL-2的原核表达及单克隆抗体的制备与鉴定 从ConA刺激的健康奶牛外周血淋巴细胞中提取总RNA，应用RT-PCR方法反转录为cDNA作为模板，并扩增429 bp大小的目的基因。随后将目的基因分别与表达载体pET-30a(+)和pGEX-6p-1连接构建重组质粒。将鉴定正确的重组质粒转入宿主菌，分别构建pET-30a-BoIL-2/BL21(DE3)和pGEX-6p-1-BoIL-2/BL21。对重组菌进行诱导表达后，SDS-PAGE鉴定结果显示目的条带大小分别为21 kDa和41 kDa，与预期大小相一致。Western Blot结果显示其具有良好的免疫反应性。以纯化融合蛋白rHis-BoIL-2免疫6周龄BALB/c小鼠，经三次免疫后，采用淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合。以纯化融合蛋白rGST-BoIL-2作为检测原，采用间接ELISA方法检测筛选阳性细胞克隆，经2次亚克隆，获得11株能稳定分泌特异性BoIL-2单抗的杂交瘤细胞株，分别命名为1A3、1D3、2G7、3C10、3D8、5D10、5F11、5G2、5G6、6D7和6E5。亚类鉴定结果显示，除1A3和6E5亚类为IgG2b型，2G7亚类为IgG2a型，3C10和5G2亚类为IgG3型，其余6株单抗的亚类均为IgG1型。效价测定结果显示，除3C10上清效价为1∶2560，2G7和5G2的上清效价为1∶5120外，其余细胞上清效价均在1.0×104以上，11株单抗腹水效价均在1.0×106-3.0×107之间。另外，11株单抗均与商品化大肠杆菌表达BoIL-2和毕赤酵母表达BoIL-2有较好的反应性。Western Blot结果显示所获得11株单抗均与融合蛋白rHis-BoIL-2和rGST-BoIL-2有反应，而与对照组pET-30a/BL21(DE3)和pGEX-6P-1/BL21空载体细菌不发生反应。特异性鉴定结果显示11株单抗只与相应的融合蛋白有反应，与其它重组细胞因子均无交叉反应。流式检测结果显示3D8、5D10、6D7和6E5四株单抗与天然BoIL-2具有较好的反应性。 2.牛分枝杆菌Ag85A单克隆抗体的制备与鉴定 以纯化融合蛋白rGST-Ag85A作为免疫原，采用淋巴细胞杂交瘤技术制备稳定分泌牛分枝杆菌Ag85A抗体的杂交瘤细胞株。以纯化融合蛋白rHis-Ag85A作为检测原，采用间接ELISA检测方法，筛选阳性细胞克隆，经2次细胞亚克隆共获得9株能稳定分泌牛分枝杆菌Ag85A特异性单抗的杂交瘤细胞株，分别命名为1C6、2E6、2F2、3B8、3D9、4B3、4F3、5B9和6B5。亚型鉴定和效价测定结果显示，9株单抗均为IgG1型，腹水效价均在1.0×106-1.0×108之间，细胞上清效价均在1.0×104以上。Westem Blot试验和IFA试验结果显示，9株单抗均与原核表达rHis-Ag85A、rGST-Ag85A，真核表达GFP-Ag85A，以及rBCG∷Ag85A和wtBCG细菌中Ag85A抗原都有较好的特异性反应，单抗3D9与真核表达GFP-Ag85B和GFP-Ag85C有反应，单抗4B3与真核表达GFP-Ag85C有反应。 综上所述，本研究共制备11株能稳定分泌抗BoIL-2特异性单抗和9株稳定分泌抗牛分枝杆菌Ag85A特异性单抗的杂交瘤细胞株。经鉴定BoIL-2单抗和Ag85A单抗均具有识别相应天然抗原的活性，为牛结核病的检测、诊断等研究提供了重要的生物材料。
单克隆抗体;牛白细胞介素-2;牛分枝杆菌Ag85A;生物活性
扬州大学
硕士
遗传学
陈祥;焦新安
2015
中文
Q813.2
58
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）