结核分枝杆菌PPE25、PPE27和PE19蛋白对巨噬细胞RAW264.7的影响及表达ppe25基因的重组耻垢分枝杆菌的构建
结核病(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosiscomplex，MTBC)感染引起的慢性呼吸道传染病，世界上三分之一的人口已被感染，每年新发病例接近九百万例，它在世界范围内传播、发病是其盛行的原因之一。pe/ppe基因占据结核分枝杆菌基因组编码区的10％，PE/PPE蛋白家族中一些成员被鉴定为是毒力因子，参与宿主免疫反应，但大部分PE/PPE蛋白的确切功能还需要探索，其中包括PPE25、PPE27和PE19蛋白。本研究利用原核体系表达和纯化获得的PPE25、PPE27、PE19蛋白与小鼠巨噬细胞RAW264.7相互作用以初步解析其生物功能。此外，为以后更深入地研究该家族蛋白的功能和在机体免疫调节中的作用，成功构建了带有FLAG标签的重组穿梭表达载体pMV261-ppe25，并电转化至无毒快速生长的耻垢分枝杆菌，从而获得重组菌株。 1.结核分枝杆菌PPE25、PPE27和PE19蛋白对巨噬细胞RAW264.7细胞因子和死亡方式的影响 纯化获得重组蛋白PPE25、PPE27和PE19，去除内毒素后经过鲎试剂测定内毒素含量，BCA法测定蛋白浓度。按照浓度0、1.25、2.5、5.0和10.0μg/mL分别刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7，作用24 h后，用Cell Proliferation ELISA BrdU(Colorimetric)试剂盒检测细胞活性，发现PPE25、PPE27和PE19对RAW264.7的活性有显著的抑制作用(p＜0.05)，且呈现剂量依赖性。 重组蛋白以不同浓度作用于巨噬细胞RAW264.7，作用24和48 h采用AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡试剂盒检测细胞死亡方式。结果显示，PPE25、PPE27和PE19都导致RAW264.7发生细胞坏死，说明PPE25、PPE27和PE19蛋白都具有毒性。同时，应用液体悬浮芯片系统luminex200方法检测不同浓度的重组蛋白PPE25、PPE27和PE19与RAW264.7相互作用后培养上清中细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-12p40的表达量的变化，从而评价PPE25、PPE27和PE19对RAW264.7炎性反应的影响。重组蛋白PPE25、PPE27和PE19分别以1.25、2.5、5.0和10.0μg/mL的浓度刺激RAW264.7，作用24和48h后，与空白组相比，重组蛋白PPE25引起IL-6分泌量显著上调(p＜0.05)，TNF-α分泌量有所上升。重组蛋白PE19引起IL-6分泌量显著上调(p＜0.05)，TNF-α分泌量没有明显差异。然而重组蛋白PPE27引起IL-6分泌量显著下调(p＜0.05)，TNF-μ分泌量也下调。此外，重组蛋白PPE25、PPE27和PE19促使巨噬细胞IL-1β表达量均低于检测线2.13 pg/mL，IL-12p40表达量均低于检测线2.09 pg/mL。这些差异表达证实重组蛋白PPE25、PPE27和PE19可以通过调控促炎性因子IL-6的表达引起巨噬细胞免疫应答。 2.表达结核分枝杆菌ppe25基因的重组耻垢分枝杆菌的构建 以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板，采用PCR技术扩增ppe25基因序列并添加FLAG标签，以便Western-blot检测其表达。将PCR产物定向克隆到克隆载体pCR2.1，测序结果与GenBank公布的基因序列完全一致。 经BamH I/EcoR I双酶切获得ppe25酶切片段，克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261，通过酶切及PCR鉴定正确后，将重组质粒pMV261-ppe25电转化耻垢分枝杆菌mc2155感受态，构建、筛选重组耻垢分枝杆菌，命名为rMS-pMV261-ppe25。重组耻垢分枝杆菌的PCR和酶切鉴定表明构建正确。重组菌经45℃30min诱导表达，超声裂解后的Western-blot结果表明，目的蛋白与抗PPE25兔多抗血清和抗FLAG标签单克隆抗体发生特异性的反应，与预期条带大小39.51kD一致。
结核分枝杆菌;PE蛋白;PPE蛋白;生物学功能
扬州大学
硕士
遗传学
焦新安
2015
中文
R378.911
54
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）