牛布鲁氏菌抗原蛋白的克隆表达及其刺激能力的评价
布鲁氏菌病（Brucellosis，简称布病）是由布鲁氏菌（Brucella）引起的一种人兽共患传染病。感染布病之后会累及多个器官的功能衰退，表现为流产和不孕不育等症状，且病程较长，难以治愈，严重者丧失劳动和生活能力。布病在世界各地的广泛流行，在给社会造成重大经济损失的同时也严重威胁着社会的健康安全，及时准确地诊断布病是防控布病的关键因素之一。常规的布病诊断方法利用LPS作为检测抗原，但由于布病疫苗的使用以及LPS与耶尔森菌等之间存在抗原结构相似性，布病的诊断容易出现假阳性和交叉反应，所以只有先进的实验室诊断方法才能准确诊断布病。 本研究通过大肠杆菌原核表达系统成功表达了rHis-L7/L12（基因名rplL）、rHis-Bp26、rHis-GroEL、rHis-CuZn-SOD（基因名sod1）、rHis-P39和rHis-Omp25等6种布鲁氏菌抗原蛋白，并使用其中的5种以可溶形式表达的重组蛋白及布鲁氏菌素(Br-PPD)进行牛布病外周血IFN-γ体外释放试验，以期望筛选出具有良好刺激效果的特异性IFN-γ刺激原，为进一步研究奠定基础。 1、布鲁氏菌6种抗原蛋白的重组表达、纯化和鉴定 根据目的基因序列设计引物，通过PCR扩增的方法获得rplL、groEL、bp26、omp25、p39和sodl目的片段，大小分别为375 bp、1641 bp、753 bp、642 bp、1206 bp和522 bp，将目的片段连接到载体并进行测序确认。将测序正确的目的片段转入表达载体，最终构建了pET-28a(+)-rplL、pColdⅠ-groEL、pColdⅠ-bp26、pColdⅠ-omp25、pColdⅠ-p39和pColdⅠ-sod1原核表达质粒，分别将6种重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)。经IPTG诱导表达以及SDS-PAGE结果分析，分别出现预期的目的条带，大小分别为20 kDa、65 kDa、33 kDa、28 kDa、47 kDa和24 kDa，说明重组蛋白获得表达，其中rHis-L7/L12、rHis-GroEL、rHis-Bp26、rHis-P39和rHis-CuZn-SOD以胞内可溶形式表达，rHis-Omp25为包涵体形式表达。通过His免疫亲和层析法进行蛋白的纯化，Western blot结果显示6种重组蛋白均能与His单抗发生特异性反应，表明6种重组蛋白获得成功表达。 2、牛布鲁氏菌抗原蛋白的刺激能力评价 使用本实验表达纯化的5种重组蛋白以及Br-PPD进行牛布病外周血IFN-γ体外释放试验的检测。在临床样品的刺激实验中，以L7/L12为刺激原的IFN-γ释放试验与ELISA检测结果之间表现出最高的正相关性(Pearson's r＞0.6)，其次为Br-PPD(Pearson's r＞0.2)具有一定相关性，也表现出一定的刺激潜力;在5种重组蛋白以及Br-PPD进行的样品检测中，以L7/L12和Br-PPD为刺激原的IFN-γ体外释放试验与ELISA检测结果之间具有较高的符合率（总符合率均为89.0％），L7/L12的敏感性、特异性、阳性符合率和阴性符合率分别为50.0％，96.7％，75.0％和90.7％，表现出作为刺激原的潜能。Br-PPD的敏感性、特异性、阳性符合率和阴性符合率分别54.8％，94.1％，70.8％和88.9％，显示出良好的刺激能力。而其他4种重组蛋白则没有显示出较好的符合率。综上所述，在5种候选抗原和Br-PPD中，Br-PPD和L7/L12作为牛布病外周血IFN-γ体外释放试验的刺激原具有明显优势，而Bp26、GroEL、P39和CuZn-SOD不具有作为刺激原的潜力。
布鲁氏菌病;抗原蛋白;蛋白表达;IFN-γ刺激原
扬州大学
硕士
遗传学
焦新安;陈祥
2015
中文
R378.5
53
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）