4b型单核细胞增生李斯特菌InlF蛋白的致病机制研究
单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）是重要的食源性人兽共患李斯特菌病的病原菌。在其多种毒力因子的作用下，Lm能突破宿主的肠道屏障、血胎屏障和血脑屏障进行扩散和传播，所引发的感染具有较高死亡率。在Lm感染宿主的过程中，能凭借其独特的表面蛋白入侵宿主的吞噬细胞及多种非吞噬细胞，并在胞内存活和增殖。内化素蛋白家族是其中一类重要的毒力因子，Lm的黏附侵袭作用与其多种内化素蛋白密切相关，InlF蛋白为内化素家族成员，其氨基酸序列在临床脑膜炎型分离株和食品及环境分离株间差异较大，但迄今为止尚未对其功能特性进行深入研究。本文以从暴发李斯特菌病的绵羊脑内分离的血清型4b的Lm NTSN菌株的InlF蛋白为研究对象，以多种非吞噬细胞及小鼠和豚鼠为实验模型，深入研究4b型菌株InlF蛋白的致病作用，为揭示Lm致病机理提供了新认识。 1、Lm内化素家族基因体内外感染条件下转录表达特性 以5种非吞噬细胞（人结直肠腺癌细胞系Caco-2、人肝癌细胞系HepG2、人脑内皮细胞HBMEC、鼠肝细胞系BRL3A、鼠成纤维细胞系NIH3T3）为体外感染模型，BALB/c小鼠和豚鼠为体内感染模型，利用实时荧光定量PCR的方法对LmNTSN体内外感染后的9种内化素基因（inlA、inlB、inlC、inlC2、inlD、inlF、inlI、inlJ、vip）的转录表达特性进行研究。结果显示，在体外感染条件下，除HBMEC细胞外， Lm感染非吞噬细胞系后其inlF、inlI、inlJ、vip基因均显著上调表达;在体内口服感染条件下，内化素基因在小鼠及豚鼠脾脏和肝脏中的相对转录水平趋势一致;大脑中内化素基因的转录表达存在差异，其中inlF、inlI、vip基因仅在豚鼠脑组织中显著性上调。以上结果提示，除小鼠脑组织外，inlF基因在Lm体内外感染中发挥重要作用;此外，还预示4b型Lm感染小鼠和豚鼠的致病机制存在一定的差异。 2、LmNTSN内化素蛋白InlF的生物信息学分析及原核表达 本研究对LmNTSN的inlF基因进行了克隆，并对其编码蛋白的结构和功能进行了生物学信息预测。结果显示，InlF蛋白是一个含有亮氨酸重复区域(LRRs)和LPXTG结构的细胞壁表面蛋白，其N末端含有长为35个氨基酸的信号肽序列，13个LRRs序列在蛋白的高级构象上内凹形成口袋状，与内化素InlA蛋白结构相似，C末端的LPXTG结构可被转肽酶A(StrA)识别切割并共价结合于细胞壁磷壁酸。利用MEGA5软件对InlF氨基酸序列进行分析，结果显示LmNTSN的InlF蛋白与谱系Ⅰ中菌株的InlF蛋白高度同源，而谱系Ⅰ、Ⅱ中菌株的InlF蛋白同源性较低(78％)。利用低温表达载体pCold成功地表达了InlF蛋白，SDS-PAGE结果显示，40kDa的目标蛋白以包涵体的形式存在。以弗氏佐剂联合InlF蛋白皮下免疫BALB/c小鼠，用间接ELISA方法对InlF蛋白免疫小鼠产生的抗InlF血清IgG效价测定结果显示，血清效价为1∶800。InlF蛋白的生物信息学预测为其功能研究提供了依据，该蛋白的原核表达和多抗的制备为其功能研究提供了生物材料。 3、LmNTSN△inlF缺失株的构建及其生物学特性的研究 利用同源重组技术成功地构建了inlF基因的缺失突变株LmNTSN△inlF，以五种非吞噬细胞系为体外感染模型、小鼠和豚鼠为体内感染模型，对其功能进行了研究。RT-PCR试验结果表明，缺失突变株中的inlF基因不能有效转录;提取LmNTSN△inlF的菌体蛋白进行Western blot分析，结果显示抗InlF的多克隆抗体未检测到大小为88kDa的靶蛋白，从转录水平和蛋白水平证明inlF基因已成功从NTSN基因组中敲除。缺失突变株LmNTSN△inlF的生长曲线、生理生化特性结果显示，inlF基因缺失突变株在BHI液体培养基中的生长及代谢特性与野生株相比无显著性差异。 选用五种人源和鼠源的非吞噬细胞（人结直肠腺癌细胞系Caco-2、人肝癌细胞系HepG2、人脑内皮细胞HBMEC、鼠肝细胞系BRL3A、鼠成纤维细胞系NIH3T3）为体外感染模型进行细胞黏附、侵袭实验。结果显示，△ inlF缺失株对细胞黏附侵袭的能力与野生株相比无显著差异。选取小鼠小肠为体外、体内感染模型，对InlF在早期感染中的作用进行测定。结果显示，在体外和体内感染小肠1h时，△inlF缺失株对肠道黏附能力均显著低于野生株（P＜0.05）;在体内感染3h和5h时，△inlF缺失株分别在派伊尔氏结和肠系膜淋巴结中定植，且其在肠系膜淋巴结中的载菌量与野生株之间存在显著性差异(P＜0.05)，由此表明InlF蛋白在Lm感染早期的黏附和定植过程中发挥作用。 此外，以小鼠和豚鼠为体内口服感染模型，对inlF缺失株在体内的感染动态、组织分布和病理变化进行了测定。结果显示，在小鼠口服感染4h时，△inlF缺失株在肝脏中的定植数量显著低于野生株(P＜0.05)，而脾脏、小肠、肠系膜淋巴结中的载菌量与野生株相比无明显差异;在后期感染中，△ inlF与野生株在这些内脏中的定植数量无显著差异。口服感染豚鼠6h后，△inlF缺失株在脾脏、肝脏中的定植能力显著降低（P＜0.01，P＜0.05）;感染24h后，在脾脏、肝脏中的增殖能力均极显著低于野生株(P＜0.001)。病理切片结果显示△ inlF缺失株对豚鼠的毒力明显低于野生株。由此可知，与小鼠感染模型相比，InlF蛋白在Lm感染豚鼠后突破肠道屏障并在脾脏、肝脏中的定植和致病中发挥更加重要的作用。 综上所述，对谱系Ⅰ的4b型菌株LmNTSN的InlF蛋白功能研究结果表明， InlF蛋白对Lm突破小鼠和豚鼠肠道屏障过程中的早期黏附、侵入及在肝脏中的定植发挥重要作用;对Lm口服感染豚鼠后在肝脏和脾脏中定植的作用强于对小鼠的感染和致病作用，表明InlF蛋白是4b型菌株NTSN的重要毒力因子，本研究为探索InlF蛋白在Lm感染宿主中突破肠道屏障和血脑屏障的机制奠定了基础。
李斯特菌病;4b型李斯特菌;InlF蛋白;蛋白表达
扬州大学
硕士
遗传学
殷月兰;焦新安
2015
中文
R378.8
73
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）