对虾细胞基因转移技术研究以及对虾早期胚胎microRNAs的挖掘
对虾病毒病的频繁爆发已对世界对虾养殖业造成了巨大的经济损失，在体外建立永生性对虾细胞系对于研究对虾病毒的侵染机制以及制备有效的抗病毒药物或疫苗具有十分重要的意义。将永生性转化因子导入对虾原代培养细胞是建立永生性对虾细胞系的一种有效手段。但是由于体外培养对虾细胞不分裂并且难以被转染等问题，对虾永生性细胞系一直未获成功。因此，急需建立和完善适用于对虾细胞的有效的基因转移技术。目前，对虾的遗传转化技术已有了初步的尝试，所用表达载体分为非病毒和病毒两种。这些方法均存在较大的缺点，主要表现为高致死率和低转化率。 本文拟(1)克隆对虾翻译控制肿瘤蛋白基因（TCTP）的启动子(Ptctp)和对虾白斑病毒(WSSV)早期基因ie1的启动子(Pie1)，并将其分别插入病毒和非病毒表达载体中，构建含有双启动子的表达质粒，通过比较它们在哺乳动物细胞、鱼类细胞和对虾原代培养细胞中启动基因转录和表达的活性，从而寻找适用于对虾细胞的高效启动子。(2)将SV40增强子序列插入上述表达载体中，研究其在哺乳动物细胞和对虾原代培养细胞中促进质粒入核的作用，以寻找适用于不分裂的对虾培养细胞的促进外源基因表达的增强子。(3)为了提高现有逆转录病毒基因转移系统对对虾细胞的侵染偏好性，本文拟克隆对虾白斑病毒WSSV的两种主要囊膜蛋白基因:vp19和vp28，构建真核表达载体，并通过共转染包装细胞的方法，将其引入所包装病毒颗粒的囊膜上，以期提高现有逆转录病毒基因转移系统的嗜对虾细胞性。(4)由于非编码microRNAs在控制细胞分裂和细胞周期调控中发挥重要作用，因此，本文拟通过生物信息学方法，从对虾早期胚胎转录组序列中预测可能的microRNAs及其靶基因，从而对调控对虾胚胎发育和细胞周期的相关microRNAs进行挖掘。 在对虾翻译控制肿瘤蛋白基因启动子Ptctp的活性研究方面，我们成功克隆了刀额新对虾和日本囊对虾翻译控制肿瘤蛋白基因的启动子序列，分别命名为Pme-tctp和Pmj-tctp，长度为612 bp，并利用软件TFsearch和Match对其可能的转录因子结合位点进行了预测。同时，成功克隆了增强型绿色荧光蛋白基因(eGFP)的编码框序列，然后以pMCs-GFP为基本质粒（含启动子PLTR），利用双酶切反应将上述2种启动子分别定向插入该质粒启动子(5' LTR)之后，绿色荧光蛋白基因(GFP)或eGFP序列之前，或以eGFP基因替换GFP基因，从而构建了以下五种逆转录病毒表达载体质粒，分别为:单启动子质粒pMCs-PLTR-eGFP以及双启动子质粒pMCs-PLTR-Pme-tctp-GFP、 pMCs-PLTR-Pmj-tctp-GFP、pMCs-PLTR-Pme-tctp-eGFP和pMCs-PLTR-Pmj-tctp-eGFP。通过脂质体法将上述五种载体质粒转染哺乳动物细胞Plat-GP后，在荧光显微镜下均可检测到明显的绿色荧光信号。与双启动子质粒相比，单启动子质粒pMCs-PLTR-eGFP介导的绿色荧光表达效率和强度均最大，这表明在哺乳动物细胞中LTR启动子对基因的转录表达起主要作用，而Pme-tctp和Pmj-tctp的插入对LTR启动子启动下游报告基因的的表达造成了一定的影响。通过脂质体法将上述五种表达质粒转染刀额新对虾Oka器官原代培养细胞中，发现，单启动子质粒pMCs-PLTR-eGFP转染细胞中未观察到绿色荧光蛋白表达，而其他4种双启动子质粒均可检测到绿色荧光，这表明双启动子表达载体可在对虾细胞中有效启动基因的转录和表达。PCR和RT-PCR检测结果也表明，脂质体法可以把表达质粒导入对虾细胞中，但单启动子质粒不能被转录表达，双启动子质粒则可以被转录表达出mRNA，这与荧光显微镜下观察的结果一致。 在提高现有逆转录病毒基因转移系统的嗜对虾细胞性方面，我们成功克隆得到了对虾WSSV两种囊膜蛋白VP19和VP28的基因编码框序列，长度分别为366 bp和615 bp，分别编码121和204个氨基酸。将其定向插入真核表达载体pcDNA3.1/V5-HisA，成功构建了pcDNA-VP19和pcDNA-VP28两个重组表达质粒。通过共转染不同组合的包装质粒与病毒报告质粒到包装细胞Plat-GP中:(1)pMCs-PLTR-eGFP和 pCMV-VSV-G;(2) pMCs-PLTR-Pme-tctp-eGFP和pCMV-VSV-G;(3)pMCs-eGFP、pCMV-VSV-G、pcDNA-VP19和pcDNA-VP28;(4)pMCs-PLTR-Pme-tctp-eGFP、pCMV-VSV-G、pcDNA-VP19和PcDNA-VP28,进行病毒包装、滴度测定和对虾原代培养细胞感染，以比较该系统的嗜对虾细胞性上的变化。结果表明，所包装病毒的滴度可达到(1.9-2.1)×108 TU/ml。包装病毒侵染对虾原代培养细胞48小时后，没有共转染对虾WSSV囊膜蛋白表达质粒pcDNA-VP19和pcDNA-VP28的包装病毒颗粒以及单启动子驱动的表达载体所包装的病毒颗粒所感染对虾细胞中均未观察到绿色荧光表达。只有共转染组合(4)包装而形成的病毒颗粒，才能成功介导报告基因在对虾原代培养细胞中表达，虽然只检测到较少的阳性克隆，且荧光强度较弱，但这一结果表明，将对虾WSSV囊膜蛋白VP28和VP19引入逆转录病毒基因转移系统可明显提高该系统的嗜对虾细胞性，虽然效率不高。 为了探讨对虾WSSV囊膜蛋白VP28和VP19在提高逆转录病毒基因转移系统的嗜对虾细胞性上的作用机理，本文利用DAS、Topred2、Tmpred以及HMMTOP四种软件对VP19和VP28蛋白的疏水性进行了分析，发现VP19中第36-55和第95-114个氨基酸之间，VP28中第7-27个氨基酸之间为可能的跨膜结构域。为验证包装细胞内过表达的VP19和VP28蛋白是否能定位于质膜上，本文分别将eGFP和mCherry基因定向插入到去终止密码子的vp19和vp28基因序列的C-端，构建了两种融合蛋白表达载体:pcDNA-VP19-ΔTAA/eGFP（绿色荧光标记VP19蛋白）和pcDNA-VP28-ΔTAA/mCherry（红色荧光标记VP28蛋白）。利用脂质体法将以上两种融合蛋白表达载体导入Plat-GP细胞中，过表达48小时后，通过激光共聚焦显微镜成功观察到过表达的VP19和VP28蛋白定位于细胞膜上。这表明本文改造过的逆转录病毒基因表达系统的嗜对虾细胞性与对虾WSSV囊膜蛋白VP19和VP28的引入有关。 在对虾早期胚胎的microRNAs挖掘方面，本文又以Illumina平台获得的对虾早期胚胎转录组序列为参考，利用BlastN与RNAfold分别进行同源比对分析以及二级结构分析，最终获得了21条保守的miRNAs序列，分别属于19个miRNAs家族，分别为mja-miR-14、44、242、287、317、927、966、969、1014、1175、2491、2731、2774、2788、3338、3885、4961、6489和6493。为验证所预测的对虾miRNAs的真实性，并比较其在不同发育时期的miRNAs的表达模式，我们进一步通过RT-qPCR技术分析了这些miRNAs在对虾原肠胚时期和无节幼体时期的miRNAs表达模式。发现，只有其中的15条miRNAs成功扩增得到了阳性条带;原肠胚时期的miRNAs表达水平与无节幼体时期呈现出不同的表达模式;其中mja-miR-3885在两个发育时期均具有极高的表达量，表明该miRNAs在对虾胚胎的发育过程中具有重要的作用。 靶基因预测结果表明，以转录组中所有unigene作为参考数据库，通过miRanda算法和一套严格标准进行预测和筛选，最终得到了120个靶基因序列。利用GO和KEGG数据库对所有预测的靶基因进行分析研究，结果表明所有的靶基因在细胞组分上分为11个类别，在分子功能上分为10个类别，在生物学功能上分为18个类别。其中19个靶基因涉及31个代谢通路，主要的代谢途径有:RNA降解途径、Wnt信号通路、细胞周期以及矿物质吸收等，这些对胚胎发育均具有重要作用。在靶基因预测的过程中，11个靶基因被注释与对虾胚胎的发育行为和免疫有关。本文还对其中的七个基因进行了RPKM值统计以及RT-qPCR表达丰度分析。上述miRNAs及其靶基因在不同发育时期的表达模式结果提示我们，对虾也具有一个复杂的miRNA: mRNA调控网络用于精准调控其胚胎发育过程。 总之，本文对对虾TCTP基因启动子(Ptctp)和WSSV早期基因ie1启动子(Pie1)在对虾原代培养细胞中的活性以及SV40增强子序列在对虾细胞中的DTSs活性进行了系统分析，发现这两种启动子均能介导外源基因在对虾细胞中的表达，虽然表达效率还不高。SV40能够明显提高动物细胞中载体的入核效率。本文还在此基础上建立了一套嗜对虾细胞的逆转录病毒基因表达系统，并证明了该系统的嗜对虾细胞性与对虾WSSV囊膜蛋白VP19和VP28的引入有关。通过生物信息学预测得到了21个可能的对虾早期胚胎microRNAs和120个靶基因，对microRNAs在对虾胚胎发育过程中的作用进行了初步研究。 以上的研究结果为今后开展细胞水平上的外源基因导入和表达，甚至将来的活体对虾转基因技术研究以及对虾的miRNAs研究奠定了技术基础。
对虾病毒病;永生性细胞系;基因转移技术;早期胚胎组织;非编码小分子核糖核酸
中国海洋大学
硕士
遗传学
郭华荣
2015
中文
S945.46;S945.19
197
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）