miR-206调控ANXA2在PASMCs表型转换中的机制研究
背景和目的: “肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)表型转换”是肝肺综合征(hepatopulmonary syndrome，HPS)进程中重要病理生理改变之一。HPS是慢性肝病的一种严重并发症，以肺内微血管异常扩张、动脉血氧和作用异常为主要表现。因为既往诊断标准的不统一，肝肺综合征在肝硬化患者中的发病率从4％到47％不等，确诊后2.5年死亡率达到了41％。因为对肝肺综合征具体发病机制还不是太清楚，目前尚缺乏有效的治疗药物，原位肝移植被认为是唯一有效的治疗方式。过去的研究已经表明肺血管重塑在肝肺综合征发病机制中扮演了重要作用。在肺血管重塑发展过程中，肺动脉平滑肌细胞由静止型（收缩型）向合成型（分泌型）转化;肺微血管内皮细胞向平滑肌样细胞分化是两个基本的病理生理改变。因此，明确肺动脉平滑肌细胞表型转化的分子机制，可以进一步促进我们对肝肺综合征的了解。膜联蛋白A2(Annexins A2，ANXA2)是钙依赖磷酸结合蛋白超家族的一员。在许多恶性肿瘤相关研究中发现其可以调节细胞的增殖，迁移，骨架形成，血管生成，例如肝癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌。目前我们的研究表明，ANXA2在肺动脉平滑肌细胞表型转化过程中起了重要作用。MicroRNAs(miRNAs)，是一种小非编码RNA，在转录后水平调节细胞多种生物学过程。在肺血管重塑的发展进程中，某些特定阶段miRNAs的表达参与PASMCs表型转化在其中发挥着重要的作用。鉴于转录水平的调控ANXA2表达的作用并不明显，我们推测是否存在潜在的miRNAs通过调节ANXA2基因的表达参与了肺动脉平滑肌细胞表型转化。 方法: 实验分五部分 1.构建HPS大鼠模型并制备血清，培养原代PASMCs 采用慢性胆总管结扎构建HPS大鼠模型，2周后行病理切片及血气分析，成功后制备血清。采用组织块法培养原代PASMCs。 2.生物信息学分析，HPS大鼠血清刺激PASMCs后对SMα-actin、ANXA2和miRNA-206表达进行检测 生物信息学分析预测可能靶向作用于ANXA23'-UTR的miRNAs。PASMCs随机分为2组:对照组（C组）和HPS干预组（HPS组），分别接受5％正常大鼠血清或HPS大鼠血清孵育24、48和72h后，采用western blot法分别检测ANXA2，SMα-actin表达;qRT-PCR检测ANXA2 mRNA和miRNAs的表达。 3.PASMCs转染以及ANXA2，SMα-actin的免疫荧光检测 PASMCs分别转染miR-206 mimic，miR-206 inhibitor或ANXA2过表达质粒。采用western blot法分别检测ANXA2，SMα-actin表达，及采用免疫荧光对ANXA2，SMα-actin细胞内定位。qRT-PCR检测ANXA2 mRNA的表达。 4.双荧光素酶报告基因检测 双荧光素酶报告基因检测证实miR-206是否通过直接结合到ANXA2mRNA的3′-UTR，抑制ANXA2的表达。 5.3H-Thymidine(3H-TdR)掺入法和CCK-8法检测 将miR-206 mimic和（或）ANXA2表达质粒转染入肺动脉平滑肌细胞，3H-TdR掺入法和CCK-8法观察其对HPS大鼠血清刺激导致的增殖效应的影响。 结果: 1.HPS大鼠血清对肺动脉平滑肌细胞miR-206 and ANXA2的影响。 生物信息学软件分析预测miRNA-206可以结合到ANXA2基因的3′-UTR。在肝肺综合征大鼠血清刺激组，miR-206与ANXA2的表达在不同的时间点呈负相关。 2.miR-206调节PASMCs表型转化。 PASMCs在转染miR-206mimic，miR-206 inhibitor后，表型转化标志蛋白SMα-actin与miR-206的表达水平呈正相关。 3.miR-206直接结合ANXA2 mRNA3'-UTR抑制ANXA2表达。 miRNA功能分析和荧光素酶报告基因检测表明，miRNA通过直接结合到ANXA2mRNA的3'-UTR，抑制ANXA2的表达。 4.miR-206/ANXA2通路介导HPS大鼠血清诱导的PASMCs的表型转化和增殖。 miR-206有效的抑制了HPS大鼠血清诱导的PASMCs表型转化和增殖。然而，这种效应可以在过表达ANXA2的情况下逆转。 结论: 本研究表明miR-206通过下调ANXA2基因表达，抑制了HPS大鼠血清刺激的PASMCs的表型转化和增殖。
肝肺综合征;肺动脉平滑肌细胞;膜联蛋白A2;表型转换;微小核糖核酸-206
第三军医大学
硕士
麻醉学
易斌
2015
中文
R575
61
2016-01-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）