MicroRNA-23b调节脓毒症血管内皮细胞炎症因子的表达及在脓毒症患者外周血白细胞的表达
本文分两个部分进行探讨： 第一部分 microRNA-23b调节脓毒症脐静脉血管内皮细胞炎症因子的表达 通过细菌脂多糖(LPS)刺激人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，然后转染mir-23b的模仿剂或者抑制剂进入细胞，并观察转染对mir-23b表达的上调和抑制作用，对脓毒症血管内皮细胞表达的炎症调节因子的影响。进而探讨mir-23b作为脓毒症的靶点以及生物标志物的可能性。 方法: mir-23b抑制剂和模拟剂分别被转染到人血管内皮细胞(HUVEC)从而分别抑制和上调mir-23b表达。抑制剂和模拟剂的阴性对照(NC)同样进行转染以便对照。观察LPS刺激后4h和8h后各组细胞NF-κB、TNF-α、IL-6、E选择素、ICAM-1、VCAM-1的蛋白表达和mRNA的表达，以及miR-23b表达的荧光图片，进行分析和比较。组间行x2检验或t检验，SPSS16.0统计软件进行统计分析，P＜0.05为有显著差异。 结果: 1、转染mir-23b抑制剂抑制了人脐静脉的内皮细胞中的mir-23b的表达;转染模拟剂则可促进mir-23b的表达 使用荧光显微镜可见人脐静脉的内皮细胞中，mir-23b发出绿色荧光。而定量PCR的结果则表明，mir-23b抑制剂的转染组与空白对照组及NC组相比较，其mir-23b的表达可见显著的降低，表明mir-23b抑制剂的转染抑制mir-23b的表达有效。与此相反，mir-23b模拟剂的转染组与空白组和NC组的模拟剂组相比，则发现mir-23b的表达增高，表明mir-23b模拟剂的转染可促进mir-23b表达。 2、LPS下调入脐静脉的内皮细胞中mir-23b的表达 LPS刺激的人脐静脉的内皮细胞模拟脓毒症中血管内皮细胞。结果显示，相比没有用LPS刺激细胞表达的miR-23b，转染显著模拟剂对照和拮抗剂对照的细胞LPS刺激4h或8h后的miR-23b表达明显下降(P＜0.01)。结果表明，在LPS刺激导致人脐静脉的内皮细胞的mir-23b表达减少，在脓毒症中血管内皮细胞活化伴有mir-23b表达的抑制。相反，在模拟剂转染组与没有LPS刺激的细胞相比较，LPS刺激后4h、8h检测发现，mir-23b表达轻微下降，但仍处于高水平。在抑制剂的转染组中，LPS刺激后内皮细胞所表达的mir-23b则仍然很低。 3、LPS促进炎性细胞因子表达的影响 LPS刺激人脐静脉内皮细后4h、8h检测发现，炎性因子NF-κB，TNF-α，IL-6，ICAM-1，VCAM-1和E-选择素E均显著增加(P＜0.05)，表明LPS刺激的人脐静脉的内皮细胞表达炎性细胞因子，进而导致脓毒症中的炎症反应。 4、mir-23b模拟剂抑制LPS刺激后炎症因子的表达 LPS刺激人脐静脉的内皮细胞4h、8h在转染模拟NC组的NF-κB，TNF-α，IL-6，ICAM-1， VCAM-1和E-选择素mRNA表达明显增加(P＜0.05)，与转染模拟剂组有明显差异(P＜0.05)。Western blot分析结果表明，LPS刺激后4h检测发现，模拟剂转染组的NF-κB，TNF-α，IL-6，ICAM-1和E-选择素的蛋白水平，明显低于模拟剂NC组4h(P＜0.05)。LPS刺激后8h检测发现，VCAM-1的蛋白水平在模拟剂的转染组显著的低于模仿剂NC的转染组(P＜0.05)。 5、mir-23b抑制剂的转染对LPS刺激以后细胞的炎症因子的表达产生影响 抑制剂NC转染组LPS刺激4h、8h后检测发现，其NF-κB，IL-6，ICAM-1，VCAM-1和选择素E的表达，比其刺激以前的水平有显著的增加(P＜0.05)。这些炎性因子的表达水平在抑制剂转染组LPS刺激后与刺激前比较，也明显升高(P＜0.05)。此外，抑制剂转染组与抑制剂NC转染组比较，LPS刺激后4h、8h后炎性因子水平显著升高。Western blot分析表明，与抑制剂NC转染组比较，LPS刺激后4h、8h抑制剂转染组细胞的NF-κB，TNF-α，IL-6，ICAM-1，E选择素和VCAM-1蛋白表达水平显著增加(P＜0.05)。 结论: LPS刺激后内皮细胞的miR-23b表达下降，而转染miR-23b模拟剂后，LPS刺激内皮细胞后NF-κB，IL-6，ICAM-1，VCAM-1，选择素E的表达下降，而转染miR-23b抑制剂后，LPS刺激内皮细胞后NF-κB、TNF-α、IL-6、ICAM-1、VCAM-1、选择素E的表达上调。以往研究表明，这些炎性因子均是脓毒症炎症网络系统(inflammatorynetwork)的重要组成因子，在脓毒症的发生、发展过程中起关键作用。因而我们认为，miR-23b可以通过抑制血管内皮细胞炎性因子NF-κB、TNF-α、IL-6、E选择素、ICAM-1、VCAM-1的释放，进而对脓毒症进行调节。 第二部分 microRNA-23b在脓毒症患者外周血的表达 收集样本外周血取自20例脓毒症患者、10例SIRS患者及10例正常对照组人群，记录相关的临床资料，并采用mirVana PARIS Kit方法进行样本外周血的血清中RNA抽提，然后使用AllinOne的miRNA qRT-PCR法对miRNA-23b在血清中的相对定量进行检测，同时测定血中WBC计数、血清TNF-α、IL-10水平及IL-10/TNF-α比值的变化，并结合患者的临床资料测定SOFA评分，比较脓毒症、SIRS及正常对照组血清中miRNA-23b表达的差异，分析血清miRNA-23b的表达与脓毒症患者SOFA评分、WBC计数、血清TNF-α、IL-10水平及IL-10/TNF-α比值的关系，并分析脓毒症死亡组与存活组之间的差异，从而判定其与临床指标及预后的相关性。 结果 1、miR-23b的检测灵敏度以及线性范围 miR-23b和U6检测的最低检出界限为6.97 pg/μL RNA，在6.97～6.97×104pμL的RNA范围内miR-23b和U6测定的Ct值与RNA浓度之间存在良好的线性相关关系(r＞0.999)。 2、外周血中miR-23b的温度稳定性 在4℃保存外周血循环血，1、3及5d后，其总定量RNA从51.32 ng/μL下降至18.3 ng/μL，由此可见总RNA的降解随保存时间的延长同步增多。而外周循环血的白细胞中miR-23b和U6的表达水平则没有明显变化。 3、脓毒症患者病情分析 20例脓毒症患者中病情分布为:心内膜炎患者2例，胆道感染患者2例，腹膜炎患者4例，肺部感染患者12例。28 d病死率为20％(4/20); SOFA评分2～11分，平均（5.8±2.52）分。 4、外周血中miR-23b、WBC、血清中TNF-α、IL-10水平及IL-10/TNF-α的比值变化 与对照组相比较，脓毒症组对象的miR-23b表达显著降低(P＜0.01)，同时其血液中的WBC、IL-10、TNF-α水平以及IL-10和TNF-α的比值均显著升高(P＜0.01);而脓毒症组与SIRS组之间比较，各项指标均没有统计学差异(P＞0.05)。 5、预后不同，脓毒症病患组内miR-23b、血清中IL-10、TNF-α水平以及IL-10和TNF-α的比值之间的差异 脓毒症患者组中死亡患者与存活患者相比较，miR-23b表达量明显降低(P=0.003，P＜0.01)，而血清中IL-10的水平则明显升高(P=0.037，P＜0.01)。两组患者的组间白细胞数(P=0.584)，血清中TNF-α水平(P=0.324)以及IL-10和TNF-α的比值(P=0.263)均没有显著的统计学差异(P＞0.05)。 6、脓毒症患者的miR-23b水平与其自身的WBC、血清中TNF-α、IL-10的水平以及SOFA评分之间的关系 脓毒症患者外周血miR-23b表达所需的循环数与其自身的SOFA评分、血清中的TNF-α和IL-10呈显著相关（其r值分别为0.473、0.485和0.470，P＜0.05）;其与WBC计数（r值分别为0.301）以及IL-10和TNF-α的比值均无明显相关(r值为0.039，P＞0.05)。 7、IL-10、TNF-α在脓毒症组病患的表达水平及两者的比值和SOFA评分之间的关系 脓毒症患者的SOFA评分与血清中的IL-10(r值为0.369)、TNF-α(r值为0.410)和IL-10与TNF-α的比值(r值分别为0.124)均无明显的相关性(P＞0.05)。 结论: miRNA-23b的表达水平在脓毒症组患者较正常对照组明显下降，但与SIRS组患者相比较则无明显差异。miRNA-23b的表达水平反应了机体的免疫水平，可能作为脓毒症的严重程度和判断预后的生物学分子标志物，而其能否能在脓毒症的临床辅助诊断以及预后判断中进行应用，则需要大样本量临床研究对其进一步判断，miRNA-23b在脓毒症发生和发展中的相关作用以及机制，任然有待对其进行深入的研究。
脓毒症;微小核糖核酸-23b;血管内皮细胞;炎症因子;外周血白细胞
第三军医大学
博士
麻醉学
陶国才
2015
中文
R631.2
105
2016-01-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）