基于微流控技术的环境中金黄色葡萄球菌的检测研究
金黄色葡萄球菌是环境微生物的一种，广泛的存在于自然界中。少量的金黄色葡萄球菌不会对环境产生影响，是正常的生物群落组成部分之一。但当其所在的环境适合其生长时，金黄色葡萄球菌将会大量繁殖，对该环境造成污染，并通过空气、水等介质传播，感染其中生物，导致多种疾病的产生，严重威胁到该环境中的其他生物健康，引发多种疾病甚至导致死亡，造成大量的经济损失。金黄色葡萄球菌很容易随着水体、空气进入人体中大量繁殖，产生肠毒素。引起恶心、呕吐、胃痉挛和腹泻等中毒症状，其中免疫力低下的人群如儿童和老年人其受感染，将会导致感染性休克或多器官功能衰竭，严重的可能导致死亡。不仅如此，金黄色葡萄球菌在传播污染过程中极容易发生变异产生耐药基因，引发严重的生物安全问题。 因此，检测金黄色葡萄球菌的浓度变化，对保障环境安全以及避免环境遭受大面积的金黄色葡萄球菌污染、保障人类健康、及时有效的进行生物安全的防控以及环境预警等，都具有重大意义。目前有很多学者对环境类样本中的金黄色葡萄球菌进行研究、检测，但是所用的方法大多为培养法。金黄色葡萄球菌作为生物性污染物的一种，有着能够在短时间内自我生长、繁殖的特点。不同时间对同一份环境样本中的金黄色葡萄球菌进行检测，其结果数值有着巨大的差异。因此，对金黄色葡萄球菌进行快速在线实时分析的需求日益紧迫。 微流控技术是一种新兴的技术，能够将多种反应集成到一块几个平方厘米的芯片上完成，由于其效率高、成本低、分析时间短，并且能够实现高通量、样本结果一体化(Sample to answer)、便携化检测，逐渐为了最佳的污染物检测技术之一。 在本论文中，建立了两类微流控体系，即分别为微流控—环介导等温扩增(Loop mediated isothermal amplification，LAMP)检测体系以及微流控—免疫检测体系，均能够对金黄色葡萄球菌进行高效、快速、准确、低成本的实时监测。 在微流控—环介导等温扩增检测体系的建立中，首先设计并筛选出了一套能够针对金黄色葡萄球菌nuc基因进行扩增的引物，建立了一个宏观的金黄色葡萄球菌环介导等温扩增检测体系，并用13种其他细菌作为阴性对照，对该体系的特异性进行验证。然后将这个稳定的、高特异性的环介导等温扩增体系整合在了微流控芯片中。所形成的微流控—LAMP体系将样品的处理、金黄色葡萄球菌DNA的释放、扩增以及结果的观察集成在了一个长宽均为厘米级别的芯片中，能够在一个小时左右，同时完成对4个样本检测。在将宏观状态下的环介导等温扩增金黄色葡萄球菌检测体系整合在微米级的管道中的同时，将整个反应体系从25μL缩小到了1.5μL，因此采用此体系进行检测大大减少了对试剂量的需求，同时也相应的减少了对样本量的需求。本体系检测限为10个DNA拷贝，比PCR反应低12个数量级。反应结果在365nm的紫外线下清晰可见。并且通过对芯片结构的优化，使得芯片体系制作简单、容易操作，可以整合在便携式、自动化的系统中。在实际应用中，可以实现直接在样品采集地对样本进行检测，免去了样本运送的麻烦。为验证本体系的实用性和准确性，用此体系检测了24例实际样本，并与传统的培养法进行对比。采用本体系实时监测金黄色葡萄球菌的浓度，可以有效的避免其对所在的环境造成大规模污染，对环境中的金黄色葡萄球菌的防治起到了积极作用，保障人类健康不受其威胁，应用前景较为广泛。为了适应大量样本的检测，在本研究中对上述的微流控—环介导等温扩增进行了进一步的优化，优化的体系可以同时检测12个样本。并且通过对芯片设计的优化，使得操作更为简单、方便。使用本体系对金黄色葡萄球菌进行检测，降低了检测成本以及试剂需求量，大大简化了制作过程以及操作过程，可以整合在便携式、自动化的系统中 本论文还建立了一个微流控—免疫反应体系，可以在同一个体系中同时完成对8个样品的检测，所需时间不超过40min，并且验证了芯片的特异性。相对于宏观的检测方法，本体系大大降低了样本的检测成本以及检测时间。并且将检测系统优化了以后，将能够适用于在采样现场的实时快速检测。通过荧光强度的分析，可以定量的检测样本中金黄色葡萄球菌的浓度，进行简单的环境学分析。通过利用本体系对实际样本进行了检测，并用传统的培养法做对照，进一步验证了该体系的可行性和稳定性。该方法可以用于检测养殖场废水中金黄色葡萄球菌，为废水处理方法的选择提供了可靠的数据支持。本系统通过对养殖业废水中金黄色葡萄球菌的实时检测，在控制其对环境中水体、土壤以及禽畜之间的污染起到了积极作用。 本论文中所建立的两个体系，原理不同，方式不同，但是均可以快速、准确、实时的、特异性的检测金黄色葡萄球菌。可以用两种体系对同一样本进行检测，通过对比检测结果，相互进行结果的确认。相比之下，微流控—环介导等温扩增体系比微流控—免疫体系更加灵敏，更适用于低浓度的金黄色葡萄球菌的检测。 本研究是环境工程与生物医学研究院的交叉联合项目，通过分子生物学、免疫学与微流控技术的结合，对能够引起环境污染、威胁人类健康的金黄色葡萄球菌进行了快速、准确实时检测。对金黄色葡萄球菌污染的防治起到了积极作用，对控制环境中生物性污染、保障环境安全、人类健康以及生物安全的防控、环境预警等，都具有重大意义。
金黄色葡萄球菌;环境污染;微流控技术;实时检测
复旦大学
硕士
环境工程
隋国栋
2014
中文
X172
94
2016-03-01（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）