聚3-羟基丙酸重组菌构建及代谢调控
聚3-羟基丙酸(P3HP)是一种极具开发前景的聚羟基脂肪酸(PHA)。P3HP作为新型高分子生物材料，其不仅具有良好的生物兼容性、可降解性和较高刚性，还具较好延展性和拉伸性能等，被视为塑料最佳替代品。目前，自然界中尚未发现能够天然合成P3HP的微生物，且P3HP化学合成存在很大局限性，因此，利用微生物法生产P3HP尤为迫切。本课题选取肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniaeMGH78578)为宿主，甘油为底物，通过甘油脱水酶(DhaB)、辅酶A依赖的丙醛脱氢酶(PduP)和PHA合酶(PhaC)的催化完成P3HP的积累。研究以下内容: 1、成功克隆了来源于罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha H16)的phaC1和来源于集胞藻(Synechocystis sp.PCC6803)的phbC，构建了两株重组菌K.p(pET-pk-phaC1)和K.p(pET-pk-phbC)，发酵检测两重组菌中并无可测P3HP产生，推测可能由于P3HP前体物不足导致，需要强化前体物浓度。 2、克隆来源于K.pneumoniae和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellaenterica serovar Typhimurium LT2)辅酶A依赖的丙醛脱氢酶基因(pduPKp与pduPSe)并在K.pneumoniae中表达，发现PduPse能够高效表达，其酶活为2.03 U/mg，相比于对照菌(K.pneumoniae与K.p(pET-pk))分别提高了7.58倍和5.31倍。pduPSe基因超表达对宿主菌生长、甘油消耗以及代谢流量产生了影响。重组菌K.p(pET-pk-pduPSe)能高效转化有害中间产物3-羟基丙醛，使得生物量的提高;且能够重排碳代谢流。 3、构建了P3HP重组菌株K.p(pE T-pk-pduPSe-phaC1)和K.p（pET-pk-pduP Se-phbC），研究PduP和PHA合酶串联表达重组菌P3HP的积累。结果表明，pduPSe与phaC1串联表达未明显增加宿主菌生长负荷，而不同来源的PHA合酶基因对宿主菌生物量影响具有差异。重组菌K.p(pET-pk-pduPSe-phaC1)代谢甘油速率较平稳，24h时甘油剩余量为14.26 g/L，与对照菌比甘油消耗速率能力有所降低;重组菌K.p(pET-pk-pduPSe-phbC)24 h时甘油剩余量为18.89 g/L，其甘油代谢能力低于重组菌K.p(pET-pk-pduPSe-phaC1)。 4、为探究代谢流分向对P3HP合成的影响，构建了dhaT基因敲除的重组重组菌株K.p(pET-pk-pduPSe-phaC1-△dhaT)和K.p(pET-pk-pduPSe-phbC-△dhaT)。结果表明，该重组菌株生长减慢，甘油消耗速率大幅降低，表明dhaT敲除后并没有消除1，3-丙二醇代谢途径对P3HP合成的影响，反而干扰了甘油代谢网络。该改造策略不利于P3HP积累。成功用tac启动子替换原载体中pk启动子，构建重组菌K.p(pET-tac-pduPSe-phaC1)和K.p(pET-tac-pduPSe-phbC)，经分析，tac启动子可使PduPS。与PhaC1蛋白均得以成功表达。
聚3-羟基丙酸;肺炎克雷伯氏菌;重组菌;代谢调控;生物兼容性
北京化工大学
硕士
食品科学与工程
田平芳
2015
中文
R318.08
114
2015-12-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）