海藻糖与热激蛋白共表达提高酿酒酵母乙醇耐受性
传统化石能源在使用过程中产生的一些污染颗粒和有害气体会对自然环境造成严重污染。寻求可再生的清洁能源迫在眉睫，不仅关系着全球经济的发展，也关系着人类文明的传承。清洁的燃料乙醇作为新兴能源的代表成为学者研究的热点，也受到各国政府的重视。目前发酵法是生产燃料乙醇的主要方法，但是在发酵过程中出现一些比较棘手的难题，比如乙醇胁迫、染菌等问题直接影响了燃料乙醇的产量和经济效益。发酵过程中积累的乙醇能够抑制酿酒酵母的生长，影响细胞正常的生理活动，降低乙醇的最终产量。虽然酿酒酵母对发酵液中积累的乙醇有一定的耐受能力，但是随着发酵时间延长，乙醇浓度越来越高，对酿酒酵母的抑制程度加剧。高浓度乙醇胁迫能诱导多种胁迫反应，比如热激蛋白的高效表达和海藻糖的大量积累等，这些保护物质的增加有利于增强酿酒酵母的乙醇耐受能力。 本论文旨在通过将海藻糖合成关键基因与热激蛋白合成关键基因在酿酒酵母细胞中共表达，以提高酿酒酵母的乙醇耐受性。首先，对酿酒酵母在不同浓度(0％，5％，10％，15％ v/v)乙醇胁迫下的生长曲线、细胞直径和发酵液pH值进行了测定与分析。在添加外源乙醇发酵过程中，酿酒酵母细胞生长和代谢会受到不同程度的抑制，且抑制程度随乙醇浓度升高而加剧。同时，比较了酿酒酵母细胞内海藻糖和麦角固醇在不同浓度乙醇培养下的含量差异，其中麦角固醇的含量随乙醇浓度的升高而增加，在添加乙醇浓度为15％(v/v)时最高;海藻糖含量也随着乙醇浓度升高而增加，在乙醇浓度为10％(v/v)时达到最大值。海藻糖含量和麦角固醇含量呈正相关，说明在乙醇胁迫下，两者可能协同保护酿酒酵母细胞。此外，通过实时荧光定量PCR对海藻糖和热激蛋白代谢相关基因的表达量进行测定，结果表明海藻糖合成基因tps1、tps2、tps3、tsl1的表达量随乙醇浓度升高而增加，海藻糖分解基因ath1和nth2的表达量随乙醇浓度升高而减少，但乙醇却促进了海藻糖分解基因nth1的表达;热激蛋白hsp78、hsp82、hsp104、ssa1的表达量随着乙醇浓度升高而增加。采用SPSS软件对海藻糖和热激蛋白的合成基因进行了相关性分析，结果表明两者呈正相关。 在此基础上，选取海藻糖合成关键基因tps2与热激蛋白104合成基因hsp104，对其进行基因操作，以实现其在酿酒酵母细胞中的共表达，从而提高酿酒酵母乙醇耐受性。对tps2和hsp104进行PCR扩增，并通过双酶切与质粒pYSE2进行连接，将重组质粒转入大肠杆菌BMTOP10中，筛选阳性克隆，测序结果显示没有突变，序列完全正确。tps2和hsp104与质粒pYES2的基因重组完成并保存于大肠杆菌BMTOP10中，再利用上述重组质粒构建tps2和hsp104的串联共表达质粒并转化酿酒酵母。
酿酒酵母;乙醇胁迫;海藻糖;热激蛋白;重组质粒;耐受性;发酵法
北京化工大学
硕士
药学
李灏
2015
中文
TQ223.122;TQ923
89
2015-12-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）