表面展示生物合成α-熊果苷的研究
α-熊果苷作为一种安全无毒的美白制剂广泛添加于各类化妆品中，其生产方式主要靠酶催化合成，但酶合成有诸多不足。本课题尝试将表面展示系统与酶相结合，从本实验筛选出的嗜麦芽黄单胞菌(Xanthomonas MaltopHilia BT-112)中扩增出能催化合成α-熊果苷的葡糖基转移酶XgtA基因，与冰核蛋白Inak进行N端融合将葡糖基转移酶XgtA展示在细菌表面。将构建出的基因工程菌通过IPTG诱导表达后再通过SDS-PAGE分析，该蛋白在大肠杆菌中能正确表达，且为可溶性蛋白，再利用带有荧光标签的抗体与融合蛋白末端带有的组氨酸标签结合，通过荧光显微镜和流式细胞仪证实了XgtA被展示在细胞表面。 本课题对诱导条件进行初步优化，得到了最适诱导温度为15℃，诱导时间为24h，最适IPTG浓度为0.4mmol·L-1。由于对苯二酚存在底物抑制效应，所以本实验还从提高菌体自身耐受度着手，通过梯度平板筛选将能够耐受低浓度对苯二酚的菌株筛选出来，并接着利用点种法将初筛菌株进行复筛，最终得到了最大耐受浓度为4％（对苯二酚364mmol·L-1）的菌株。 本课题将构建的重组菌BL21-P-I-X进行全细胞催化反应，初步确定了催化反应结束时间为72h，底物为麦芽糖，反应温度为25℃，pH值为7，对苯二酚与麦芽糖的摩尔比为1∶10，且初始添加对苯二酚浓度为150mmol·L-1。在全细胞催化中人工添加抗氧化剂（抗坏血酸），和黄原胶均能减少对苯二酚对菌体的氧化作用，当添加抗坏血酸为5mmol·L-1时，α-熊果苷产量提高了43.4％;当添加黄原胶为0.1％时，α-熊果苷产量提高了53.4％。此外，本实验还以大孔树脂H103对对苯二酚进行固定化，以便高效利用对苯二酚，固定化后α-熊果苷产量提高了23.2％。 本课题从解决对苯二酚毒副作用入手，对菌株筛选和保护，为之后的表面展示生产α-熊果苷提供了参考。
细菌表面展示;α-熊果苷;葡糖基转移酶;全细胞催化;生物合成;化妆品;添加剂
北京化工大学
硕士
化学工程与技术
张鹏
2015
中文
TQ658
111
2015-12-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）