肺炎克雷伯氏杆菌利用甘油产3-羟基丙酸的代谢工程研究
平台化合物3-羟基丙酸（3-Hydroxypropionic acid，3-HP）因其良好的化学变通性近年来受到了极大的关注。传统的化学法生产3-羟基丙酸因环境污染大、成本高等因素，制约了该化合物的广泛使用。近来，生物法从甘油合成3-羟基丙酸因其良好的环境兼容性及低成本的底物价格优势，成为未来生产3-羟基丙酸工业化生产的可行道路。肺炎克雷伯氏杆菌因其较快的生长速度及较高的甘油耐受性，成为了3-羟基丙酸生产的首选宿主菌。本研究针对肺炎克雷伯氏杆菌进行了一系列代谢工程的改造，使其3-羟基丙酸的生产能力得到了大幅度提升，同时也对该平台菌种进行了基础研究，完善了该非模式菌中的分子操作技术，主要包括以下内容。 1、针对3-HP生产中的两个关键酶甘油脱水酶(GDHt)和醛脱氢酶(ALDH)的酶活差异导致的生产不平衡性，在K.pneumoniae中构建三种载体，将两者的编码基因dhaB和ald4用三种不同的方式进行连接，即dhaB优先表达、ald4优先表达及两基因分别用各自的启动子同时表达。结果发现，摇瓶中优先表达ald4的重组K.pneumoniae的3-HP产量最高，在24 h达2.14 g/L，相比于其他两株菌，该菌ALDH酶活为最高，为35.16 U/mg，而GDHt酶活最低。该结果表明，平衡后的表达方式增加了3-HP生产能力，减少了中间产物的积累。接着测试了来自酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae的ald4、来自E.coli的aldH和来自K.pneumoniae的puuC基因编码的ALDH在K.pneumoniae中的催化活性。结果表明，puuC基因编码的ALDH具有较高的活性，其酶活达到了50.35 U/mg。工程菌K.pneumoniae(PB-puuC)在摇瓶中的3-HP产量达到7.21 g/L，5L发酵罐中达到20g/L，展现出了较大的生产潜力。 2、为了提高ALDH在K.pneumoniae中的酶活，在K.pneumoniae中进行了再生NAD+的研究。寻找了来自S.cerevisiae中甘油3-磷酸脱氢酶编码基因GPD1、来自K.pneumoniae中NADH脱氢酶编码基因nadh及来自K.pneumoniae中NADH氧化酶编码基因naox体内表达催化NADH变为NAD+。结果表明，NADH氧化酶有着最高的NAD+再生活性，其酶活达到57 U/mg。构建含有NAD+再生及ALDH共表达载体的K.pneumoniae后，重组菌Kp(NALD)展现出活性最高的NAD+再生活力，达到40.84 U/mg，且相应的ALDH活性也有了较大提高，达55.51 U/mg。但发酵结果显示，含有NADH氧化酶载体的重组Kp(OXLD)的3-HP产量最高，24 h时达2.12 g/L，且由于辅酶的操控，该重组菌的生物量比对照组提高了8％，OD600达到了1.5。本实验通过体内调节辅酶比例，调整了代谢流的流向及生物量的积累，且寻找到了副反应最小的NADH氧化酶为后续提升产量奠定了基础。 3、依照假单胞菌Pseudomonas sp.AIU362中编码NAD+不依赖型的醛氧化酶AOX基因序列人工合成了888 bp的alod基因，连接至pET-28a和pET-pk载体上，分别转化至E.coli及K.pneumoniae中表达。SDS-PAGE显示AOX在两宿主菌内均得到了较好表达。经测定，AOX对正丙醛及3-羟基丙醛(3-HPA)的酶活分别达到了16.6U/mg及13.7 U/mg，初步证明了AOX催化3-HPA合成3-HP的可能性。经双倒数法测定，AOX对3-羟基丙醛的Km值和Vmax值分别达到了6.68 mM和41.8μ mol/min/mg。分子模拟结果显示其与ALDH存在着较大的结构上的差异。重组菌K.pneumoniae(pk-alod)的摇瓶发酵结果显示，3-HP产量在24 h达到0.85 g/L，对照组为0.6 g/L。后续上罐发酵中，K.pneumoniae(pk-alod)的3-HP产量在24 h达到3 g/L。这是国内外首次使用NAD+独立型醛氧化酶进行3-HP的生产。 4、利用合成生物学中的MAGE技术，对非模式菌种K.pneumoniae进行了大规模的基因组改造。首先构建了外源稳定表达λRed系统重组酶的质粒pET-Red及敲除K.pneumoniae乳酸脱氢酶基因的载体pET-ud-ldh，分别使用Red系统及RecA系统敲除了dhaT基因及ldh基因，并在dhaT基因的位置上用aldH基因代替，构建了平台工程菌Kpac。利用Kpac为宿主进行了单链介导的重组，重构了多于30条甘油相关代谢途径。最终筛选了201株菌进行3-HP产量的测定，筛选出一株3-HP产量最高的宿主菌，并命名为Kp3。经酶活检测，Kp3的ALDH、GDHt和PDOR的酶活分别达到3.83 U/mg、11.17 U/mg和3.94 U/mg，均高出K.pneumoniae及Kpac。测序结果显示Kp3的突变发生在另一个ldh基因和poxB基因上，编码了3-HP生产中产生副产物乳酸及乙酸的关键酶。在无抗生素及诱导剂加入的情况下，Kp3在摇瓶中3-HP产量可达到0.6 g/L，在5L发酵罐中3-HP产量达6.39 g/L。之后测试并利用反义mRNA技术抑制了K.pneumoniae中的乳酸及乙酸的代谢流，并同时引入了aldH基因以提升3-HP的合成能力。结果表明，相对于只表达aldH的Kp(pET-aldH)，引入乳酸和乙酸的反义模块的重组菌Kp(pET-rLB-aldH)乳酸及乙酸的产量有了明显的降低，同时该重组菌3-HP产量得到了提高。该现象说明3-HP的生产与副产物乳酸乙酸的生成为相互竞争的关系，并未后续提高3-HP的产量提供了思路。 5、为了提高K.pneumoniae的3-HP生产能力，对重组K.pneumoniae进行了组合优化。寻找了组成型的lac启动子及诱导性的tac启动子，分别连接在pUC19及pET-28a载体上，表达K.pneumoniae自身的puuC基因，构建了重组菌K.pneumoniae(puck-puuC)和K.pneumoniae(ptac-puuC)。利用组成型产3-HP的菌种K.pneumoniae(puck-puuC)优化了甘油发酵培养基，最佳成分为K2HPO4·3H2O5.1 g/L,KH2PO41.95 g/L,(NH4)2 SO48g/L,MgSO4·7H2O0.125 g/L，酵母粉4 g/L。利用诱导性3-HP生产菌K.pneumoniae(ptac-puuC)优化了IPTG浓度和发酵pH值，最终分别确定为0.02 mM及pH7。摇瓶发酵测定两株工程菌的代谢流量，发现在tac启动子的作用下，重组菌K.pneumoniae(ptac-puuC)减少了1，3-丙二醇及2，3-丁二醇的代谢流量，同时增加了3-HP的代谢流量，其3-HP产量达2.93 g/L。在优化后的培养条件下经过精细的发酵调控，重组菌的3-HP产量达到73.4 g/L，甘油转化率达到52％，在副产物乳酸及乙酸有了较大幅度降低的同时，高值化合物1，3-丙二醇及2，3-丁二醇也有17.9 g/L和20g/L的产生，为联产高价值化合物提供了良好的基础。为进一步增加3-HP产量，同时减少乳酸及乙酸的产量，利用RecA重组技术构建了3个打靶载体，敲除了ldh、lldd及pta基因，得到宿主菌KpF。将tac-puuC质粒转化，得到重组菌KpF(ptac-puuC)。上罐发酵结果显示，该重组菌在72 h内3-HP合成量达到了83.8 g/L，甘油转化率达54％，同时有着较少的乳酸和乙酸的产生，展现出了极大的工业化生产前景。Real-Time PCR分析结果显示，诱导tac启动子后，K.pneumoniae自身的RNA聚合酶及其相关元件编码基因都有2倍以上转录强度的增强，证明了tac启动子在K.pneumoniae中的适配性，为后续改造K.pneumoniae生产化合物提供了良好的基础。
3-羟基丙酸;肺炎克雷伯氏杆菌;甘油;代谢工程
北京化工大学
博士
化学工程与技术
田平芳
2015
中文
TQ920.6
123
2015-12-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）