一种嗜热脂肪酶的表达、表征及机理研究
脂肪酶是一类重要的生物催化剂，它广泛应用于洗涤、食品、医药等工业领域，相对于化学催化剂，它具有很多的优点，如副产物少，反应条件温和等。而微生物来源的脂肪酶则成为了近年来工业用酶的主要来源，随着人们对微生物脂肪酶的研究深入，它的应用范围也正在逐渐扩大，对酶的应用条件（温度，有机溶剂等）的要求也越来越高，因此开发出具有特殊酶学性质的脂肪酶具有很高的工业应用价值。 近年来，嗜热微生物特殊的理化性质以及嗜热酶独特的催化活性和稳定性得到了众多学者的关注，从而推动了酶工程的发展，为酶的工业应用奠定了基础。本文将从菌株Thermusthermophilus HB8中分离出来的脂肪酶基因EST与载体质粒pET22b(+)重组之后，在大肠杆菌中正常表达，得到了一种嗜热型脂肪酶，蛋白分子量为25kDa，考马斯亮蓝法测定粗酶液中蛋白质的含量为2.89mg· mL-1。通过基因突变的技术，设计引物并进行PCR，以本实验室的pET22b-EST基因为模板，添加了组氨酸标签，没有影响基因的表达，成功的在大肠杆菌中表达。利用镍柱中的填充物氯化镍可以特异性的吸附含有组氨酸的蛋白质的特性，将EST脂肪酶进行纯化，并取得了很好的纯化效果。 EST脂肪酶在40℃～90℃的温度范围内，均表现出一定的酶活。并且在一定的温度范围内，EST脂肪酶的活性随着温度的升高逐渐升高，在70℃时达到最大值，即为最适温度。当温度升高到80℃时，尽管酶的活性开始下降，但是相对酶活仍然是最适温度时酶活的70％，这说明在高温下，EST脂肪酶仍能表现出很好的催化活性。EST嗜热脂肪酶不仅最适反应温度较高，而且在高温下也表现出较好的热稳定性。EST脂肪酶在80℃的高温下处理3h后，依然保持有50％的相对酶活。 考察了不同的有机溶剂对酶活的影响时发现:当添加一定浓度的甲醇和二甲基亚砜时，EST脂肪酶的活性明显提高了。当二甲基亚砜的浓度和甲醇的浓度被逐渐升高时，EST脂肪酶的相对酶活会随着浓度的增加而逐渐提高，最后，二甲基亚砜促进酶活的最大浓度达到了56％，甲醇促进酶活的最大浓度达到了45％。另外，当EST脂肪酶在不同的这两种有机溶剂中处理60min时，虽然对比未用有机溶剂长时间处理，处理之后的酶活会有所下降，但是56％的二甲基亚砜仍然能使EST脂肪酶的酶活性提高到原始酶活的7倍，45％的甲醇使EST脂肪酶的酶活性提高到原始酶活的3倍。 为了验证有机溶剂在促进酶活的同时，是否会破坏酶的结构。我们对EST脂肪酶进行了动力学参数的测定和蛋白质二级结构的测定。动力学参数测定结果显示:EST嗜热脂肪酶的米氏常数Km为0.14mM· L-1，最大反应速度Vmax为0.42U·mg-1，Kcat为0.19s-1;而EST脂肪酶经不同浓度的不同有机试剂处理后，在56％的二甲基亚砜(DMSO)中米氏常数Km、最大反应速度Vmax Kcat值分别为1.23mM· L-1、9.55 U·mg-1、4.42s-1;在45％的甲醇中米氏常数Km、最大反应速度Vmax Kat值分别为1.34 mM·L-1、3.38 U·mg-1、0.62 s-1。将它们与未处理酶液的米氏常数Km相对比，我们发现这几个数值相差不大。因此，我们可以认为在误差允许的范围内，在不同的溶剂中测定出来的这三个米氏常数是相同的，也就是说二甲基亚砜和甲醇在促进酶活性的同时并没有改变酶的本质。利用圆二色谱法对EST蛋白酶进行了二级结构的测定，通过蛋白质二级结构软件计算之后，得到的α螺旋含量为35.7％，而经10％、20％、44％以及45％的甲醇处理后，α螺旋的含量分别为29.2％、30.8％、25.4％和21.7％，α螺旋的含量有所降低。
脂肪酶;嗜热微生物;极性有机溶剂;二级结构;同源建模;理化性质
北京化工大学
硕士
食品科学与工程
刘珞
2015
中文
Q556
92
2015-12-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）