产烷烃基因工程菌的构建
随着全世界范围内原油消耗量的激增，通过节能减排来实现可持续发展已经成为我们所必须关注的问题，因而关于如何用可再生生物质来替代化石能源，逐渐成为新生的热点课题。烷烃，是化石能源的主要组分，但迄今为止，学术界对于利用微生物这一“细胞工厂”来生产烷烃的研究仍涉及甚少。本课题利用基因工程及合成生物学领域的研究方法，通过调控烷烃生物合成过程中关键酶的表达，使微生物细胞只需通过简单的代谢就可以产生烷烃，为传统石化燃料造成的排放问题、新型生物燃料不能完全替代石化燃料等问题提供了一个绝佳的解决方案。产物中十一烷的生成是本课题的一项重大突破。 本课题的研究工作主要围绕以下几个方面展开: (1)烷烃生物合成途径的构建及验证;分别扩增来源于不动杆菌两种不同菌株的酰基辅酶A还原酶基因acr1/acrM，和来源于念珠藻的醛脱羰基酶基因dc，并构建成两套表达体系pETDuet-acr1-dc以及pETDuet-acrM-dc。在发酵过程中外源流加C14∶0/C16∶0的脂肪酸，并检测最终发酵液中是否含有目标产物烷烃，以验证所构建途径的可行性。最终结果显示含有acrM和dc的代谢途径可以成功将脂肪酸转化成相应链长的烷烃，故在后续实验中对这条途径加以利用。 (2)以基因工程手段调控产物烷烃链长;在上述研究的基础上引入来源于月桂树的特异性硫酯酶基因uc，该基因可以使大肠杆菌体内积累以C12∶0/C14∶0为主的中链游离脂肪酸，并充当产烷烃代谢过程中的底物。实验结果显示，利用表达盒pETDuet-uc-acrM-dc，成功将大肠杆菌内源积累的中链脂肪酸还原，在每克细胞干重中得到总量为6.43±0.25 mg的目标产物中链烷烃，其中，十一烷的产量为2.03±0.07 mg·g-1，十三烷的产量为1.51±0.18 mg·g-1，十五烷的产量为2.89±0.37 mg·g-1。 (3)中链烷烃的产量优化;扩增大肠杆菌内源的fadD基因，该基因控制表达的酰基辅酶A合成酶可以使细胞内积累的游离脂肪酸更多的转化为酰基辅酶A，从而为后续烷烃生物合成途径提供过量底物。实验结果显示，经fadD调节后目标产物中链烷烃的总产量由6.43±0.25 mg·g-1提高到了8.05±0.37 mg·g-1，其中十一烷的产量提高到2.21±0.18 mg·g-1，十三烷的产量提高到1.83±0.12 mg·g-1，十五烷烃的产量提高到4.01±0.43 mg·g-1。由于源于植物的ACP和硫酯酶结合更为紧密，故在后续实验中还引入了来源于麻风树的ACP多肽链基因acpP、 ACP合成酶基因acpS及脂肪酸合成酶系的几个基因，利用酰基ACP的分流作用，尝试在大肠杆菌内源更多的积累游离脂肪酸，从而提高终产物烷烃的产量。 本课题的创新点在于，所构建的代谢途径异源表达至大肠杆菌并利用可再生生物质作为底物发酵后，成功在发酵液中检测到目标产物烷烃。这条烷烃生物合成途径以大肠杆菌内源的酰基辅酶A为底物，既规避了可逆反应的发生，又可以通过特异性硫酯酶对产物链长进行调控。本实验最终得到的产物包括十一烷、十三烷等中链烷烃，与传统航空燃油中的烷烃无异，为可再生能源的开发开辟了一条崭新的途径。
烷烃;生物合成;代谢工程;基因工程菌
北京化工大学
硕士
食品科学与工程
刘珞
2015
中文
Q78
111
2015-12-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）