重组人白细胞介素-1α(rhIL-1α)的毕赤酵母表达及生物学作用研究
人白细胞介素-1α(hIL-1α)在抗肿瘤等方面具有潜在的应用价值。目前，重组hIL-1α(rhIL-1α)表达主要是通过大肠杆菌表达系统，但大肠杆菌表达系统存在蛋白分离纯化工艺复杂等缺点。 酵母表达系统具有蛋白表达后修饰及分离纯化工艺简单等优点，本文构建了rhIL-1α毕赤酵母工程菌，挑选表达量高的菌株，在1L摇瓶和3L发酵罐规模下进行了表达条件的优化，在10L和50 L发酵罐规模进行了样品的获取、产物纯化工艺以及初步的活性研究。为rhIL-1α的产业化研究奠定了基础。主要研究包括: 1、本研究对hIL-1α的cDNA序列进行设计和优化，采用pPICZαA作为目的基因的表达载体，通过电转化法将重组质粒转化至X-33毕赤酵母。通过基因组PCR鉴定，MM和MD平板筛选，SDS-PAGE鉴定等方法筛选得到高表达且遗传稳定的rhIL-1α工程菌。 2、在1L摇瓶规模下对rhIL-1α工程菌的发酵条件进行优化。结果表明，在pH5.5、26℃、甲醇浓度0.25％条件下，rhIL-1α的表达量最高(19 mg/L)。 3、在3L发酵罐规模下对rhIL-1α工程菌的发酵条件进行优化。结果表明，在pH5.5、26℃、甲醇浓度0.25％条件下，rhIL-1α的表达量最高(180 mg/L)。 4、扩大发酵规模获取样品。在pH5.5、26℃、甲醇浓度0.25％条件下，10L和50L发酵罐中的表达量分为251 mg/L和307 mg/L。 5、对rhIL-1α的分离纯化条件进行摸索。通过高速低温离心、双水相、超滤以及DEAE阴离子交换层析处理后，获得了纯度高于90％，收率大于50％的目的蛋白。 6、采用MTT法检测rhIL-1α对人肝癌细胞BEL-7402的作用并证明rhIL-1α能够抑制人肝癌细胞7402的增殖。为进一步研究rhIL-1α对肿瘤的临床治疗奠定了理论基础。
重组人白细胞介素-1α;毕赤酵母;发酵条件;分离纯化;生物学活性
河南师范大学
硕士
生物学·生物工程
徐存拴;张世馥
2015
中文
TQ920.6
74
2015-12-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）