IL-1Ra在毕赤酵母中的高密度发酵、分离纯化和生物学作用研究
白细胞介素1受体拮抗剂(interleukin1 receptor antagonist，IL-1Ra)是天然的受体拮抗剂，可与白细胞介素1(interleukin1，IL-1)的受体结合但不引起信号转导，从而竞争性抑制IL-1与其受体结合所产生的生物学效应，有效降低IL-1表达过多导致的不良反应。本文研究了重组人白细胞介素1受体拮抗剂(recombinant human interleukin1 receptorantagonist, rhIL-1Ra)的毕赤酵母工程菌在不同规模下的表达条件、分离纯化工艺以及生物学作用。 首先，本文研究了1L摇瓶规模下不同诱导温度和pH对rhIL-1Ra表达量的影响，结果发现，rhIL-1Ra在pH为5.5、诱导温度28℃条件下表达量达到最高，两种形式（糖基化和非糖基化）的rhIL-1Ra表达量分别为12和10 mg/L。 其次，本文在摇瓶条件基础上对3L发酵罐规模下rhIL-1Ra的最优表达条件进行研究，包括:起始诱导菌体密度、溶氧、温度、pH、甲醇浓度和诱导时间。确定的最佳表达条件为:起始诱导时发酵液光密度(OD600)为600，溶氧为20％，诱导温度28℃，诱导pH5.0，诱导时间6d，甲醇浓度0.25％。在最优条件下，糖基化和非糖基化rhIL-1Ra的表达量分别达到110和90 mg/L。 再次，本文对rhIL-1Ra的分离纯化工艺进行了研究。确定的最优工艺为:低温离心→双水相萃取→超滤→DEAE-阴离子交换层析→SP-阳离子交换层析等，最终得到纯度大于95％，收率分别达到56％、40％的糖基化和非糖基化rhIL-1Ra。 最后，本文利用MTT和Hoechst33258染色分别测定了糖基化和非糖基化rhIL-1Ra对rhIL-1β促进B16细胞凋亡的拮抗作用。结果表明，两种形式的rhIL-1Ra对rhIL-1β均有拮抗作用，且随着rhIL-1Ra浓度的升高，对IL-1β的拮抗作用越明显。 综上，本文研究了rhIL-1Ra的毕赤酵母工程菌在不同规模下表达条件优化，rhIL-1Ra的分离纯化和生物学作用，并首次研究了糖基化和非糖基化rhIL-1Ra的生物学作用差异。其中，糖基化和非糖基化rhIL-1Ra在3L规模下均得到较高的表达量(110和90 mg/L)，建立了糖基化和非糖基化rhIL-1Ra的分离纯化工艺，获得纯度大于95％，收率达到56％的糖基化rhIL-1Ra，纯度大于95％，收率达到40％的非糖基化rhIL-1Ra;对糖基化和非糖基化rhIL-1Ra的生物学作用测定发现，两种rhIL-1Ra对rhIL-1β促进B16细胞凋亡均有拮抗作用，且糖基化和非糖基化rhIL-1Ra的生物学作用没有明显差异。本文为rhIL-1Ra的作用机理研究提供了理论支持，并为其产业化奠定了基础。
白细胞介素1受体拮抗剂;毕赤酵母;发酵条件;分离纯化;生物学作用
河南师范大学
硕士
生物工程
徐存拴;张世馥
2015
中文
TQ920.6
71
2015-12-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）