重组人生长激素(rhGH)的毕赤酵母工程菌构建、表达、分离纯化及其生物学作用研究
人生长激素(human Growth Hormone，hGH)对人体的生长和发育有重要的调节作用，生长激素的缺乏会导致生长障碍等疾病的发生，含hGH类药物可治疗上述疾病。目前，临床应用的hGH主要通过DNA重组技术在大肠杆菌(E.coli)中表达获得。酵母属于真核生物，在真核蛋白表达和分离纯化工艺方面比大肠杆菌更有优势。本文选用毕赤酵母表达系统，通过构建高效表达的重组人生长激素(recombinant human Growth Hormone，rhGH)工程菌、优化表达条件、研究分离纯化工艺，并初步测定其生物学作用。 本文对hGH的cDNA序列进行设计和优化，并进行人工合成，采用3种质粒(pPIC9、pPIC9K、pPICZα-A)作为目的基因的表达载体，通过电转化法将重组质粒转化至3种毕赤酵母(X-33、GS115、SMD1168)中进行表达，并对不同载体-宿主组合的表达量差异进行比较。采用表达量最高的组合(X-33和pPICZα-A组合，简称X-Zα)进行了1L摇瓶和3L发酵罐发酵条件的优化，并对其分离纯化工艺进行研究，最后在体外对rhGH的生物学作用进行初步测定。研究结果包括: 1.研究不同载体-宿主组合对rhGH表达量的影响，结果表明，在X-33与pPICZα-A组合时rhGH表达量达到最高。 2.对1L和3L规模的发酵条件进行优化，结果表明，在1L摇瓶规模时，最佳诱导温度和pH为23℃和pH6.0;在23℃、pH6.0进行3L发酵罐发酵时，当采用基础盐培养基(Basal Salts Medium，BSM)时表达量最高为300.0 mg/L左右，较大肠杆菌表达rhGH的量高。 3.对rhGH分离纯化工艺进行研究，最终经高速冷冻离心、双水相、超滤以及离子交换层析处理后，获得了收率大于60％，纯度高于90％的rhGH。 4.对获得的rhGH初步进行生物学活性测定，结果表明，rhGH对人正常肝细胞QSG-7701和人肝癌细胞Bel-7402的生长和增殖具有促进作用。 本研究获得的rhGH具有表达量高，纯化工艺简单等优点，并初步研究其生物学作用，为rhGH的毕赤酵母产业化生产奠定了基础。
重组人生长激素;毕赤酵母;表达条件;分离纯化;生物学作用
河南师范大学
硕士
生物工程
徐存拴;张世馥
2015
中文
TQ920.6
72
2015-12-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）