卵巢癌相关抗原CA125胶体金免疫层析检测方法的初步建立
卵巢癌是女性生殖器最常见的三大恶性肿瘤之一，因其发病初期无典型临床症状，多数患者就诊时已处于患病晚期。因此，如何在卵巢癌发病早期准确诊断就显得尤为重要。研究发现，糖类抗原125（Carbohydrate antigen125，CA125）作为妇科临床最常用的血清型肿瘤标志物，对上皮性卵巢癌具有一定的特异性和敏感性，在卵巢癌的预防、辅助诊断、病情评估以及术后疗效等方面具有非常积极的意义，可作为卵巢癌防治的主要监测指标。目前CA125的检测技术主要有化学发光法及酶联免疫法等，所使用的检测试剂盒大多为昂贵的进口或国内分装试剂，且检测时均需依赖相关检测仪器在实验室进行，检测成本较高，不适合于基层医院进行大规模初筛和床旁快检。因此，急需寻找一种简便、快速的检测技术，为临床诊断提供依据。 本研究采用正辛酸-硫酸铵沉淀法纯化CA125包被和标记单克隆抗体，经透析后用紫外分光光度计测定280nm处吸光值，根据经验公式计算出两种抗体的蛋白浓度，再通过SDS-PAGE对两株抗体进行纯度鉴定。采用柠檬酸三钠还原法并控制柠檬酸三钠加入量的不同而制备不同粒径的胶体金，对其最适粒径、胶体金制备工艺、标记pH、最佳标记蛋白量、金标稀释液加入量、硝酸纤维素膜、样品垫处理液、划膜液和最佳包被抗体量等因素进行选择优化，并对试纸条的稳定性、特异性、灵敏度进行性能研究及实验室临床标本评价，制备出能快速检测人血清中CA125的胶体金检测试纸。 实验结果表明，纯化后获得的抗体纯度较高，其中每3mL抗体腹水纯化后获得1mLCA125包被抗体，浓度为14.93mg/mL，1.15mL标记抗体，浓度为15.08mg/mL。采用的24.5nm胶体金颗粒相对均一，且性能稳定。胶体金制备的最优工艺为:加热至沸腾时间8min，200rpm最大转速，颜色稳定后继续加热5min。通过反应模式优化，建立了胶体金检测试纸条工艺:胶体金与蛋白标记pH为7.5，标记蛋白浓度为1.4mg/mL，金标稀释液加入量为300μL/mL，NC膜选用TEST NC膜，样品垫处理液最佳配方组合为0.03MpH8.8 Tris、0.3％Tween-20、0.5％pvp、0.3％柠檬酸，质控线和检测线包被蛋白浓度1.5mg/mL，以此方法建立的试纸条灵敏度为35U/mL，且不与CEA、AFP、CA50、CA15-3、CA19-9发生交叉反应，37℃加速破坏实验21d后显示该试纸条稳定性良好。临床评价结果显示:200份临床标本的检测阳性符合率100/100，阴性符合率98/100。 本研究成功建立了CA125胶体金免疫层析双抗体夹心检测方法，该检测方法具有较高灵敏度、稳定性、特异性。
卵巢癌;糖类抗原125;正辛酸-硫酸铵沉淀法;胶体金免疫层析;双抗体夹心检测
河南师范大学
硕士
遗传学
王云龙
2015
中文
R737.31;R446.6
79
2015-12-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）